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RBM28在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

2024-04-10 79 上传者：管理员

摘要：目的:分析RBM28在肝细胞癌组织中的表达水平及与患者临床病理特征的相关性，探讨RBM28在肝细胞癌中的临床意义。方法:通过生物信息学分析RBM28在肝细胞癌组织和正常组织中的表达水平以及与患者预后的关系。采用免疫组织化学和蛋白质免疫印迹法检测RBM28在肝细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达水平，并分析其与患者临床病理特征的相关性。此外，还使用qRT-PCR法检测RBM28 mRNA在组织中的表达水平。结果:经过生物信息学分析，发现RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达水平明显高于正常组织，并且高表达组患者的总生存期(OS)明显低于低表达组患者。进一步实验分析发现，RBM28蛋白及mRNA在肝细胞癌组织中的表达水平均高于癌旁正常组织(P<0.01)。此外，RBM28蛋白的表达与肝细胞癌患者的年龄、性别、微血管侵犯、甲胎蛋白和乙肝无关，但与肿瘤大小和TNM分期有关(P<0.05)。结论:RBM28在肝细胞癌组织中高表达，与肿瘤大小、TNM分期和预后不良相关，有望成为肝细胞癌潜在的分子标志物及治疗的新靶点。

关键词：
HCC
RBM28
临床病理特征
肝细胞癌
肝脏肿瘤
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一。据报道，原发性肝癌目前是继肺癌、结直肠癌之后的全球第三大癌症死亡原因，每年约有83万例患者死于该病。在原发性肝癌中，肝细胞癌是最常见的亚型[1]。肝细胞癌的发生和发展受多种致病因素的影响，在我国，慢性乙肝病毒感染和黄曲霉素暴露被认为是其主要的危险因素[2]。肝细胞癌的恶性程度高、预后差，但早期肝细胞癌大多无明显临床症状，导致多数患者在确诊时已经处于晚期，错过了根治性手术治疗的最佳时机[3,4],即便使用TACE和靶向免疫治疗等方法，也很难获得理想的效果。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)目前仍然是肝细胞癌最主要的生物标志物，然而仍有30%的肝细胞癌患者AFP表现为阴性(<20 ng/mL)[5]。因此，发现新的分子标志物对于肝细胞癌的早期诊断和针对性治疗都有着十分重大的意义。RNA结合蛋白家族的多位成员在肝细胞癌中异常表达，并调控癌基因和肿瘤抑制基因的表达和功能[6]。RNA结合基序蛋白28(RNA-binding motif protein 28,RBM28)则属于该家族的一员，研究表明，RBM28能够通过与抑癌基因p53的DNA结合域相互反应，抑制p53的转录活性，从而促进肿瘤细胞的存活和生长[7]。然而，目前对于RBM28在肝细胞癌中的作用了解甚少，本研究着重探究了RBM28在肝细胞癌组织中的表达水平以及与肝细胞癌患者临床病理特征之间的关系，为肝细胞癌的诊断和治疗提供新的依据。

1、资料和方法

1.1 组织样本

收集2021年1月至2022年12月在我院肝胆胰脾外科接受肝细胞癌手术治疗患者的术后癌组织及对应的癌旁正常组织(距离癌组织最远处取材，距离≥2 cm, 未被肿瘤组织浸润)52例。纳入标准：所有患者病理证实为HCC;术前均未行放、化疗等辅助治疗。排除标准：合并其它部位的恶性肿瘤；临床资料缺失。收集患者的发病年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、微血管侵犯、甲胎蛋白、乙肝及病理诊断等临床病理资料。本研究经我院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.2 主要试剂

从武汉三鹰生物公司购得RBM28抗体(16484-1-AP)和GAPDH抗体(10494-1-AP)。从福州迈新公司购得免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒和EDTA抗原缓冲液。从北京索莱宝公司购得Western blot相关试剂。从美国Invitrogen公司购得Trizol试剂盒，从美国Thermo Scientific公司购得cDNA逆转录试剂盒，从珠海莫纳生物科技公司购得qRT-PCR检验试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

利用R语言及UALCAN在线数据库分析肝细胞癌肿瘤组织中RBM28蛋白的表达水平，其表达数据来自癌症基因组图谱TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas);利用HCCDB肝细胞癌数据库检索RBM28在多个肝细胞癌数据集中的表达水平；利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析RBM28蛋白表达水平与肝细胞癌患者总生存期(overall survival, OS)的关系；利用人类蛋白质图谱HPA数据库提供的免疫组织化学切片探究RBM28蛋白在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达情况。

1.3.2 免疫组化

在室温下，将石蜡包埋的组织连续性切片，随后将切片经过脱蜡水化处理，加入3%的过氧化氢溶液封闭处理，持续10分钟后洗涤，使用PBS清洗3次后加入山羊血清对切片进行封闭处理。弃去血清，然后将所有切片与RBM28一抗(1∶200)进行反应，在4 ℃下孵育过夜，使用PBS 清洗后加入二抗，在37 ℃下孵育30分钟，之后使用PBS进行清洗，加入DAB溶液使切片变黄。最后用PBS清洗后加入苏木素染液，持续3分钟，用自来水冲洗后，首先将切片置入1%的盐酸乙醇中数秒，接着依次置入95%、85%、75%的乙醇、无水乙醇和二甲苯溶液中进行透明处理，最后使用封片剂进行封片。评分标准：由两位经验丰富的临床病理科医师在没有了解任何临床和病理资料的情况下，对免疫组化染色结果进行评估。染色强度评分具体规则如下：不显示染色=0分，轻微染色=1分，中等染色=2分，重度染色=3分。染色面积评分标准如下：阳性细胞数占总细胞数的比例小于5%评为0分、5%至25%评为1分、26%至50%评为2分、51%至75%评为3分、76%至100%评为4分。最后总得分=染色强度×染色面积。总得分<6分判定为RBM28低表达，≥6分判定为RBM28高表达。

1.3.3 qRT-PCR法

取适量放置于-80 ℃冰箱保存的肝细胞癌组织及对应癌旁正常组织，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA,将mRNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板，采用RBM28和GAPDH特异性引物进行qRT-PCR实验，其中RBM28正向和反向引物序列分别为5′-ACCAGCACTGAGGAGCAAGAG-3′和5′-GCTTCTTCACCTTCGTCGTCTG-3′。GAPDH的正向和反向引物序列分别为5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。PCR引物委托上海生工公司合成。

1.3.4 蛋白质免疫印迹法

将组织样品置于冰上裂解，提取蛋白质，并用BCA法测定蛋白质的浓度，按照每个凝胶孔30 μg蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，结束后转移到PVDF膜上。然后在室温下使用5%脱脂奶粉进行封闭，时间为1小时。接下来，在4 ℃下将膜与稀释后的一抗(RBM28,1∶1 000;GAPDH,1∶20 000)孵育过夜。洗涤膜后，在室温下孵育二抗[山羊抗兔IgG(H+L)-HRP,1∶6 000]1.5小时，再次洗涤膜，随后加入显影液显影目标蛋白表达相对应的条带。最后，使用Image J软件进行灰度值分析。

1.4 统计学分析

采用软件R语言(4.3.1)、SPSS 25.0及GraphPad Prism 9进行统计分析，RBM28表达与肝细胞癌临床病理特征的相关性采用χ2检验或Fisher精确概率法进行分析，RBM28在肝细胞癌组织及癌旁正常组织中的表达差异采用独立样本t检验法进行分析。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，采用Log-rank检验进行生存情况分析。所有实验结果当 P<0.05时认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 生物信息学分析HCC组织中RBM28的表达

经TCGA分析显示，RBM28蛋白在371例肝细胞癌组织中的表达显著高于 50例正常肝组织中的表达(P<0.001,图1A)。此外，在配对样本中，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达也显著高于对应的癌旁正常组织，且差异具有统计学意义(P<0.001,图1B)。通过HCCDB肝细胞癌数据库分析不同来源的肝细胞癌组织和癌旁组织中RBM28蛋白的表达水平，结果显示RBM28蛋白在5个不同来源(HCCDB1、HCCDB6、HCCDB13、HCCDB15、HCCDB16)的肝细胞癌组织中呈高表达，且差异有统计学意义(P<0.01,图1C)。利用Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析，结果显示RBM28蛋白高表达组患者的OS明显低于低表达组，且差异有显著的统计学意义(P<0.01,图1D)。HPA数据库的免疫组化结果显示，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的染色强度和阳性细胞的比例明显高于癌旁组织，并且发现RBM28蛋白含量在细胞核中明显较高(图1E-F)。以上结果提示RBM28在肝细胞癌组织中表达升高，且提示其表达水平与患者的不良预后相关。

图1 生物信息学数据库分析结果

2.2 RBM28表达水平与患者预后的关系

通过免疫组化实验分析发现，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达(69.2%,36/52)明显高于癌旁正常组织(36.5%,19/52),两组之间的比较差异有统计学意义(P<0.01,表1,图2)。根据Kaplan-Meier生存分析结果可知，RBM28蛋白高表达的肝细胞癌患者生存率明显降低(P=0.034 9,图3),提示RBM28蛋白高表达是肝细胞癌患者不良的预后因子。

表1 RBM28在肝细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达n(%)

图2 RBM28在癌旁正常组织和肝细胞癌组织中的表达(DAB显色+苏木素染色)

图3 RBM28表达水平与患者预后的关系

2.3 RBM28表达水平与患者临床病理特征的相关性

根据临床病理特征相关性分析发现，RBM28蛋白的表达与肝细胞癌患者的年龄、性别、微血管侵犯、甲胎蛋白和乙肝无关，而与肿瘤大小和TNM分期有关(P<0.05,表2)。

表2 RBM28表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系n(%)

2.4 qRT-PCR法检测 RBM28 mRNA相对表达量

采用相对定量2-ΔΔCt法来评估肝细胞癌组织及癌旁正常组织中RBM28 mRNA的表达水平，结果显示肝细胞癌组织中RBM28 mRNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P<0.01,图4)。

2.5 蛋白质免疫印迹法检测RMB28蛋白的表达

采用Western blot法检测显示，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的相对表达量明显高于癌旁正常组织，两者差异有统计学意义(P<0.01,图5)。

图4 RBM28 mRNA在癌旁正常组织(N)与肝细胞癌组织(T)中的表达

图5 RBM28蛋白在癌旁正常组织(N)与肝细胞癌组织(T)中的表达

3、讨论

RBM28是一个位于染色体7q32.1区域的核仁成分，其相对分子质量为86 kDa, 属于剪接体小核糖核蛋白(snRNP)。它在核仁应激反应中发挥重要作用[7],并在哺乳动物中高度保守[8],对于维持基因表达和生物稳态具有关键作用[9,10,11,12]。

RBM28 属于RNA结合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)家族的一员，已知其他RBPs如RBM4[13]、RBM34[14]、RBM43[15]在肝细胞癌的发生和发展中起到重要作用。在肝细胞癌中，RBPs的失调会破坏肿瘤细胞内的转录组平衡，从而推动致瘤性[16]。最新的研究表明，RBM28能够通过与抑癌基因p53的DNA结合域相互反应，抑制p53的转录活性，从而促进肿瘤细胞的存活和生长 ,此外，通过CRISPR-Cas9实验证实RBM28敲除对HCT116和U2OS细胞的增殖均有明显的抑制作用[7]。但目前对于RBM28蛋白在肝细胞癌中的表达及其生物学作用鲜有报道，因此，本研究旨在探讨RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义，为进一步研究其在肝细胞癌中的生物学功能奠定基础。

在本研究中，我们利用UALCAN数据库和HCCDB数据库分析发现，与正常组织相比，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达水平明显增高，此外，Kaplan-Meier生存分析结果显示，高表达的RBM28蛋白患者的OS明显低于低表达组，提示RBM28蛋白高表达与肝细胞癌患者的不良预后相关。HPA 数据库的免疫组化结果显示，RBM28蛋白主要在肝细胞癌组织的细胞核中表达，并且其染色强度和阳性细胞的比例明显高于癌旁正常组织。为了验证生物信息学的结论，我们通过免疫组化和Western blot法验证了RBM28蛋白在肝细胞癌组织及癌旁正常组织中的表达水平，结果显示RBM28蛋白在肝细胞癌组织中的表达明显上调，与癌旁正常组织相比差异显著(P<0.01),并且RBM28蛋白的高表达与肝细胞癌患者的肿瘤大小和TNM分期密切相关，而与患者的年龄、性别、微血管侵犯、甲胎蛋白和乙肝均无关。另外，qRT-PCR 法证实了RBM28在肝细胞癌组织中的mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，这一发现支持了RBM28可能是一个新的癌基因和肝细胞癌预后标志物的假设。需要指出的是，因本研究获取肝细胞癌标本的时间所限，研究样本量偏小，结论存在一定的局限性。因此，后续我们将从细胞和动物实验层面进一步探讨RBM28蛋白在肝细胞癌发生和发展过程中的具体分子机制。

综上所述，RBM28蛋白在肝细胞癌组织中高表达，与患者的肿瘤大小、TNM分期和预后不良相关，有望成为肝细胞癌新的分子标志物及治疗靶点。

文章来源:刘振远,牛洪凯,张顺中,等.RBM28在肝细胞癌组织中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(10):1832-1836.