人呼吸道合胞病毒（hRSV）是引起全球呼吸道疾病的主要病因，其可感染各年龄段的人群，婴幼儿重度RSV疾病发病率最高，发病高峰在1～3月龄婴儿，1岁以内的婴儿RSV感染率为60%～70%，两岁以内婴幼儿感染率为97%,3岁以内婴幼儿均感染过1次或多次RSV。RSV感染仅次于疟疾，其为1岁以内婴儿第二单病原致死病因[1]。全球每年3千多万5岁以内儿童的急性下呼吸道感染由hRSV引起，其中3百多万需住院，6.6万至19.9万死亡，99%的死亡病例发生在中低收入国家[2,3]。RSV也是老年人呼吸道疾病的主要病毒性因子，RSV引起的老年人疾病负担与季节性A型流感病毒造成的负担相当[4]。虽然经过了半个多世纪的研究，但目前仍无批准的预防性疫苗和治疗药物。由于缺乏安全有效的RSV治疗药物，迫切需要RSV预防性疫苗。疫苗研发顾问委员会认为，优先研发的适合批准要求和政策制定者需要的RSV疫苗，应确保其不仅在高收入国家，而且在中低收入国家合理使用[5]。

RSV属于单负病毒目、副黏病毒科、肺病毒属。RSV是单股负链非节段的RNA病毒，基因组约为15200bp，编码11个蛋白[6]:3种包膜糖蛋白（G、F和SH）、1种基质蛋白（M）、4种核衣壳蛋白（N、P、L和M2-1）、2种非结构蛋白（NS1和NS2）和RNA调节因子（M2-2)[7]。其中G蛋白和F蛋白负责病毒的黏附和融合，为病毒的侵入所必须，而G蛋白和F蛋白能诱导机体产生血清中和性抗体和黏膜分泌IgA，因此它们又是RSV疫苗研发的靶蛋白。核蛋白（N）与RSV的基因组RNA包装形成核衣壳蛋白复合体（RNP),RNP为病毒RNA复制和转录的模板。RSV的N蛋白、磷蛋白（P）、聚合酶大片段（L）和转录延长/终止抑制因子（M2-1）是组成RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）的主要成分，而RdRp负责RSV基因组的复制与转录[8]。RSV基因组结构为3′-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-(M2-1/M2-2)-L。RSV根据G蛋白抗原性差异，分为A和B两个血清型。病毒侵入细胞后，病毒的聚合酶以基因组为模板转录mRNA，翻译病毒蛋白质；聚合酶以负链基因组为模板复制全长正链RNA，再以全长正链RNA为模板复制形成新病毒基因组RNA，合成的病毒RNA与病毒蛋白质包装形成新病毒颗粒，以出芽的方式向细胞外释放[9]。

微型基因组是短的RSV基因组或反基因组的cDNA，病毒的大多数基因或全部基因被报告基因所取代，如荧光素酶（Luc）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）或增强型绿色荧光蛋白（eGFP），报告基因的两端含有RSV的GS(genestart）和GE(geneend）片段，报告基因的表达受GS和GE控制；微型基因组cDNA的两端含有Le(Leader）和Tr(Trailer）以及T7启动子和核酶，Le和Tr控制微型基因组的复制，核酶有助于合成的正链或负链的微型基因组获得正确的末端，驱动T7启动子的T7RNA聚合酶（T7RNP）可以通过重组病毒、表达质粒或遗传改造后的细胞株提供。由于微型基因组结构简单、片段短、易于操作，广泛应用于顺式作用原件（RNA序列）和反式作用元件（病毒蛋白）的结构与功能研究[10]。由于病毒蛋白是以反式（intrans）方式提供，不依赖微型基因组，以此方法可以研究蛋白质突变对微型基因组复制或转录的影响[11]。微型基因组也可以用于抗病毒药物的筛选和研发[12]。

本实验构建的微型基因组质粒和微型反基因组质粒是以eGFP为报告基因，替代RSV的全部基因，而保留RSV复制和转录必须的Le、Tr、GS、GE和非编码序列（noncodingsequence,NCS）。微型基因组质粒和微型反基因组质粒的区别在于插入片段的方向不同。以T7启动子驱动微型基因组或微型反基因组的复制，T7RNP是由可表达该酶的BSR-T7/5细胞提供。本实验以pcDNA3.1（+）为表达载体，构建4个辅助质粒，分别表达RSV复制和转录必须的N、P、L和M2-1蛋白。采用先感染RSV再转染微型基因组质粒或微型基因组质粒与辅助质粒共转染，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察eGFP的表达，探讨微型基因组的复制和转录特性以及各辅助蛋白的生物学活性。

1、材料与方法

1.1病毒、细胞及质粒

RSVLong株购自ATCC;BSR-T7/5细胞系（改造的幼仓鼠肾细胞，可组成性表达T7RNP）由北京交通大学何金生教授惠赠；pTeasy-eGFP、pRSV1、pRSV2[pRSV1和pRSV2是由pBluescriptⅡKS（+）质粒衍生而来，去除了原质粒的多克隆位点，引入了T7启动子（T7p）、锤头状核酶（HamRZ）、插入片段（包括Tr、GE、NCS、eGFP、NCS、GS、Le）、丁肝核酶（HdvRZ）和T7终止子（T7t),pRSV1和pRSV2的区别在于插入片段的插入方向相反（图1）]、pcDNA3.1（+）（简称pcDNA）和pcDNA-eGFP均为本实验室保存；编码RSVlong株的N、P、M2-1和L蛋白的序列经优化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆至pUC57载体中，构建亚克隆载体pUC57-N、pUC57-P、pUC57-M2-1和pUC57-L。

图1微型基因组和微型反基因组构建示意图

1.2主要试剂及仪器

胶回收试剂盒QiaquickGelExtractionkit和质粒中提试剂盒PlasmidsMidikit购自德国QIAGEN公司；Sanprep柱式质粒DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；Opti-MEM和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；内切酶XhoⅠ、KpnⅠ、SalⅠ和T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；流式细胞仪（AccuriC6）为美国BDBiosciences公司产品；数字成像系统ImageQuantLas4000购自美国GEHealthcare公司。

1.3辅助质粒的构建

表达载体pcDNA和克隆载体pUC57-N、pUC57-P、pUC57-M2-1、pUC57-L分别用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切后，连接转化构建辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M2-1和pcDNA-L，双酶切鉴定，阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.4微型基因组和微型反基因组质粒的构建

pRSV1、pRSV2和克隆质粒pTeasy-eGFP分别用KpnⅠ/SalⅠ双酶切后，连接转化构建微型基因组质粒pRSV1-eGFP和微型反基因组质粒pRSV2-eGFP，双酶切鉴定，阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.5质粒提取

用质粒中提试剂盒提取质粒pRSV1-eGFP和pRSV2-eGFP,pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M2-1和pcDNA-L。

1.6单转染微型基因组和微型反基因组质粒

转染前1d，将培养的BSR-T7/5细胞传至T25细胞培养瓶或6孔板，待细胞丰度为80%～90%时，采用脂质体Lipofectamine2000，分别将微型基因组质粒pRSV1-eGFP、微型反基因组质粒pRSV2-eGFP、阳性对照质粒pcDNA-eGFP或阴性对照质粒pRSV1单转染BSRT7/5细胞，按照试剂使用说明书操作。转染后24、48、72h，荧光显微镜下观察eGFP的表达。

1.7病毒驱动的微型基因组的拯救

感染前1d，将培养的BSR-T7/5细胞传至T25细胞培养瓶，待细胞丰度为80%～90%时，用RSVLong株吸附1h(MOI=0.01），再按1.6项方法转染微型基因组质粒pRSV1-eGFP，以未感染病毒只转染微型基因组质粒的细胞作为对照。转染后48、72h，荧光显微镜观察eGFP的表达。

1.8辅助质粒拯救的微型基因组

分别用4个辅助蛋白质粒或3个辅助蛋白质粒（缺少4个辅助质粒中的1个）与微型基因组质粒pRSV1-eGFP共转染BSR-T7/5细胞，转染后24、48、72h，荧光显微镜下观察eGFP的表达。

1.9M2-1蛋白对微型基因组拯救影响的检测

由于荧光显微镜只能定性观察共转染质粒细胞中荧光信号的高低，为了精准确定M2-1蛋白对微型基因组拯救系统的影响，用流式细胞仪定量测定共转染5个或4个质粒（缺少pcDNA-M2-1）细胞中表达eGFP的阳性细胞率。以pcDNA-eGFP为阳性对照质粒，pRSV1为阴性对照质粒。

1.10统计学分析

应用MicrosoftOfficeExcel2016软件进行统计分析，实验数据以平均值±标准偏差表示，数据的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1辅助质粒的鉴定

4个辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M2-1和pcDNA-L经KpnⅠ/XhoⅠ双酶切，分别产生大小为1187、737、596、6509bp的插入片段条带和1条5364bp的载体臂条带，大小均与预期一致，见图2。测序和同源比对分析表明，4个辅助质粒的插入片段序列与原优化序列的同源性为100%，表明4个辅助质粒构建正确。

图2辅助质粒的双酶切鉴定（KpnⅠ/XhoⅠ）

2.2微型基因组和微型反基因组质粒的鉴定

微型基因组质粒pRSV1-eGFP和微型反基因组质粒pRSV2-eGFP经KpnⅠ/SalⅠ双酶切，均产生1条3460bp的载体臂条带和798bp的插入片段条带，大小均与预期一致，见图3。测序和同源比对分析表明，两个质粒的插入片段序列与原序列的同源性为100%，表明微型基因组质粒和微型反基因组质粒构建正确。

图3微型基因组与微型反基因组质粒的酶切鉴定

2.3单转染微型基因组和微型反基因组质粒eGFP的表达

荧光显微镜观察显示，微型反基因组质粒pRSV2-eGFP转染BSRT7/5细胞后24、48和72h，均出现荧光信号，与阳性对照相同；而微型基因组质粒pRSV1-eGFP和阴性对照转染后的不同时间均未观察到荧光信号。见图4。

图4荧光显微镜观察微型基因组和微型反基因组质粒转染BSRT7/5细胞48heGFP的表达

2.4病毒驱动的微型基因组的拯救

荧光显微镜观察显示，感染RSV再转染微型基因组质粒的实验组细胞在转染后48h出现微弱的绿色荧光信号，72h后荧光强度更高；而对照组在转染后各时间均未观察到荧光信号。见图5。表明先感染RSV，再转染微型基因组质粒可以成功拯救微型基因组。

图5荧光显微镜观察RSV拯救的微型基因组

2.5辅助质粒拯救的微型基因组

荧光显微镜观察显示，共转染5个质粒和4个质粒（缺少pcDNA-M2-1）的细胞在转染后24、48和72h均观察到荧光信号，但后者较前者的荧光信号强度低；而共转染其他4个质粒（分别缺少pcDNA-N、pcDNA-P或pcDNA-L）与对照相同，在转染后各时间均观察不到荧光信号。见图6。表明辅助蛋白N、P或L对微型基因组拯救系统是必需的，而M2-1蛋白对拯救系统并不是必需的。

图6荧光显微镜观察转染48h辅助质粒拯救的微型基因组

2.6M2-1蛋白对微型基因组拯救的影响

流式细胞术检测结果显示，共转染5个或4个质粒（缺少pcDNA-M2-1）后，表达eGFP的阳性细胞率均显著高于阴性对照（P分别为2.01E-05和3.14E-05），低于阳性对照；共转染5个质粒细胞中表达eGFP的阳性细胞率显著高于共转染4个质粒（缺少pcDNA-M2-1）的细胞（P=4.92E-04）。见图7。表明M2-1蛋白对微型基因组拯救系统并不是必须的，但缺少M2-1蛋白能显著降低eGFP的表达量。

图7流式细胞术检测表达eGFP的阳性细胞率

3、讨论

本实验构建了微型基因组质粒与微型反基因组质粒，分别单转染BSR-T7/5细胞，结果转染微型反基因组质粒的细胞表达eGFP，而转染微型基因组质粒的细胞未观察到绿色荧光信号。由于转染微型反基因组质粒后，在BSR-T7/5细胞表达T7RNP作用下，转录形成类似RSV的反基因组的cRNA，其中包含的eGFP序列与eGFP的mRNA相同，可以直接翻译蛋白。已有报道细胞内合成的反基因组发挥与mRNA同样的作用[13]。单转染微型反基因组质粒，eGFP的表达并不需要RSV核衣壳蛋白的辅助，其不适用于研究微型基因组的拯救。而转染微型基因组质粒的细胞不能直接表达蛋白，需要共感染RSV或共转染4个辅助蛋白的质粒才能表达eGFP。这是由于转染微型基因组质粒，在T7RNP作用下转录形成类似RSV负链的基因组RNA，在共感染病毒或共转染辅助蛋白质粒后提供4个辅助蛋白，再与微型基因组的Le、GS、GE、Tr互相作用，复制产生正链的反基因组或转录mRNA，翻译蛋白质，其中包括eGFP，因此在共感染病毒或共转染辅助质粒的细胞中观察到荧光信号。而单转染微型基因组质粒的细胞只可得到负链的微型基因组，观察不到荧光信号。因此，后续实验均使用编码负链的微型基因组质粒作为研究微型基因组功能的材料。

M2-1蛋白作为转录终止抑制因子，具有防止转录过早终止，促进基因连接处的转录通读的作用[14]。本研究中微型基因组拯救试验结果表明，在微型基因组拯救系统中缺少M2-1蛋白表达质粒共转染的细胞中也可观察到荧光信号，但荧光信号的强度显著低于包含M2-1蛋白表达质粒的细胞，表明M2-1对微型基因组的拯救具有一定的作用，缺乏M2-1蛋白的表达质粒显著降低了微型基因组的拯救效率。而在使用微型基因组的试验中发现，微型基因组质粒与N、P和L蛋白表达质粒共转染时，可指导小于500nt的mRNA的合成，而较长的荧光素酶的mRNA(1780nt）的并未检测到；如包含M2-1蛋白的表达质粒，荧光素酶可有效合成，该过程需要完整的阅读框编码的M2-1蛋白质，M2-1的作用是特异的，且表现为剂量依赖性[15]。本研究构建的微型基因组质粒包含eGFP的基因，其长度为798bp，介于500～1780bp之间，只有在M2-1蛋白存在的条件下，eGFP基因的转录本更多，表达的蛋白量更高。

微型基因组常用的报告基因有CAT、Luc、eGFP等。根据报告基因表达的产物建立分析方法，用于分析转基因、启动子活性和药物筛选。本实验使用的报告基因为eGFP，其荧光强度为普通GFP的45倍[16]，适用于体内荧光检测，其荧光发射无种属特异性，不需要附加底物或辅助因子；但其易于淬灭，产生光量子较少，且某些细胞成分产生自身的荧光，增加了非特异性背景，缺乏酶促扩大效应，因此其灵敏性较差，再者其荧光信号较窄，不适合做定量研究。CAT适用于体外荧光或免疫检测，不适合体内分析，细胞内有内源性的CAT活性，其灵敏度仅为Luc的1%[10]。Luc催化底物发出荧光，哺乳动物细胞的内源性活性极小，其具有较高的灵敏性，为eGFP的10～100倍，尤其是萤火虫Luc线性范围较宽（7～8个数量级），已成为哺乳动物细胞使用最多的报告基因[17]。

为了保证微型基因组的拯救成功和提高拯救效率，应重点关注以下因素：构建微型基因组质粒时，在T7启动子与转录本的5′端之间加3个G，可提高T7系统的转录效率[18]；而在转录本的3′端引入核酶，如锤头状核酶或丁肝核酶，通过自切割获得正确的3′端序列，有利于微型基因组的拯救[19]。在RSV感染或RNA转染拯救重组RSV系统时，如将Le序列中第4位的胞苷酸（C）为鸟苷酸（G）替代（C4G），转录或复制效率可分别提高7或20倍[11]。在构建辅助蛋白的表达质粒时，未优化辅助蛋白基因序列的质粒与微型基因组质粒共转染，未观察到荧光信号（结果未附），而与优化后辅助蛋白基因序列的质粒共转染，观察到荧光蛋白的表达，表明序列的优化对表达蛋白的重要性。报道表明，优化后的序列比未优化的序列聚合酶的活性提高3倍多[20]。此外，转染质粒的浓度、纯度、质粒用量、各质粒的比例也是微型基因组拯救的关键。转染方法也是影响拯救效率的因素，在微型基因组拯救试验中，分别采用脂质体（Lipofectamine2000）和Jetprime进行转染，从表达蛋白的信号强度来看，前者的效率明显高于后者，为了提高转染效率，也可采用电转染的方法[21]。

综上所述，本实验建立了微型基因组拯救系统，其包含微型基因组质粒和4个辅助蛋白质粒，微型基因组质粒在RSV感染和再转染或共转染试验中均具有转录和复制功能；辅助蛋白质粒在共转染试验中证明其具有生物学功能。建立的微型基因组拯救系统为将来以反向遗传学手段拯救重组RSV以及减毒活疫苗的研发奠定了基础。

朱传凤,韦钦钦,白慕群,王婉,傅生芳,马超,高雪军.人呼吸道合胞病毒微型基因组拯救系统的建立及功能鉴定[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):665-670+675.