呼吸道感染是门诊患者就诊的常见原因[1]，病原体种类繁多，相关病毒有十余种，其中流感病毒（Flu）和呼吸道合胞病毒（RSV）是影响最广泛、感染率最高的呼吸道感染病毒[2,3,4,5]。Flu扩散极快，每年在一定区域暴发流行[6],2018、2019年我国均有较大规模流行，2019年1月我国报道2018年感染Flu死亡人数超过2017年全年的3倍[7]。世界卫生组织统计，北半球每年约1亿人感染Flu[8]。RSV则主要侵犯儿童，2～3岁儿童感染率几乎为100%[9]，全球5岁以下儿童每年约3300万感染RSV，占所有呼吸道感染病原体的20%，死亡人数为6.6万至19.9万[10,11]。呼吸道感染病毒检测方法包含病毒分离、病毒抗原或抗体免疫学检测及核酸检测等。由于检测成本、技术复杂程度、实验室条件要求较高等原因，以聚合酶链反应（PCR）为技术基础的实时荧光定量PCR(qPCR）、反转录PCR(RT-PCR）等核酸分子检测方法在基层医院用于呼吸道感染病毒检测并不现实[12]。近年来，针对呼吸道感染病毒检测的反转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）多重检测仪器越来越多[13,14]，基于GeneXpert?平台的3种呼吸道感染病毒组合多重检测系统（Xpert?XpressFlu/RSVAssay，以下简称XpressFlu/RSV）将核酸提取、PCR和结果判断整合为一体，并实现全自动化，较好地解决了技术操作烦琐和生物安全防护的难题。本研究在2018年冬春季采用XpressFlu/RSV对有急性呼吸道感染症状患者的鼻咽拭子标本进行检测，与普通PCR测序及自建RT-qPCR两种方法进行比较，评估其对主要呼吸道感染病毒的检测能力，现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

将2018年1月11日至5月9日南方医科大学珠江医院收治的具有发热、咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉疼痛、头痛、肌肉痛等呼吸道感染症状的420例患者作为研究对象。患者年龄0～82岁，平均（20.3±10.5）岁；男233例（55.5%），女187例（44.5%）；门诊患者379例（90.2%），住院患者41例（9.8%）；诊断主要包括呼吸道感染177例（42.1%），肺炎67例（16.0%），流感13例（3.1%），咽炎/扁桃体炎5例（1.2%），其他158例（37.6%）。本研究经南方医科大学珠江医院医学伦理委员会批准后进行，所有研究对象均自愿参与本研究，并签署知情同意书。

1.2标本采集

采用植绒拭子（Copan，意大利）采集所有研究对象鼻咽拭子，采集后放入密封采样管（内含3mL病毒保存液），置于冰盒内运送至实验室立即检测，或4℃暂存（不超过24h）进行检测，剩余标本-80℃保存备用。

1.3XpressFlu/RSV检测

标本振荡混匀，一次性移液管吸取300μL标本至检测盒标本仓，检测盒扫码后置于核酸检测仪（Cepheid，美国），反应34min，自动检测并判定结果。引物和探针包括以下序列：甲型流感基质（M）、甲型流感碱性聚合酶（PB2）、甲型流感酸性蛋白（PA）、乙型流感基质（M）、乙型流感非结构蛋白（NS）、RSVA型（RSVA）和RSVB型（RS-VB）核衣壳基因。每个检测试剂盒均含有标本处理质控品（SPC）和探针检查质控品（PCC）。SPC用于质控靶序列的充分提取和处理，监测PCR反应中是否存在抑制剂，即SPC在阴性标本中应为阳性，在阳性标本中既可以为阴性，也可以为阳性。PCC用于验证试剂的再水化，检测盒中PCR管的填充、探针完整性和染料稳定性。

1.4普通PCR测序

标本提取RNA，经反转录和PCR扩增，引物序列由Cepheid公司提供。普通PCR过程简述如下：反应体系共25.0μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并灭菌的MiliQ纯水（DEPC水）5.5μL，上下游引物混合物5.0μL,360反应混合物12.5μL,cDNA模板2.0μL。循环参数分为6种，（1）甲型流感病毒（FluA)M程序，95℃10min;95℃30s,57℃30s,72℃1min,40个循环；72℃5min。（2)FluAPB2程序，95℃10min;95℃30s,60℃30s,72℃1min,45个循环；72℃5min。（3）乙型流感病毒（FluB)M程序，95℃10min;95℃30s,57℃1min,72℃1min,40个循环；72℃1min。（4)FluBNS程序，95℃10min;95℃30s,54℃30s,72℃1min,40个循环；72℃5min。（5)RSVA程序，95℃10min;95℃30s,55℃1min,72℃1min,40个循环；72℃5min。（6)RSVB程序，95℃10min;95℃30s,50℃30s,72℃1min,40个循环；72℃5min。扩增产物琼脂糖凝胶电泳阳性，进行Sanger双向测序。Sequencher4.1.4软件分析结果并与参考序列比对。以扩增产物有条带，Sanger测序结果符合目标序列时为阳性。PCR测序由广州金域医学检验中心完成。

1.5实验室自建18种（型/亚型）呼吸道感染病毒RT-qPCR法[15]

XpressFlu/RSV和普通PCR测序结果不一致标本，采用自建方法确认，以任意两种方法结果一致为参考标准，计算诊断效能。简述如下：高纯度病毒RNA试剂盒（Megan，中国）提取核酸；RT-qPCR反应体系共20.0μL,TaqManTM快速病毒一步法检测混合试剂（Invitrogen，美国）5.0μL,DEPC水7.5μL，上下游引物各1.0μL，探针0.5μL，核酸模板5.0μL；循环参数分为两种：（1）呼吸道RNA病毒程序（FluA、FluA亚型H1N1-9、FluA亚型H3N2、FluB、副流感病毒1型、冠状病毒1型、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、鼻病毒），50℃10min,95℃5min;95℃15s,55℃45s,40个循环。（2）呼吸道DNA/RNA病毒共同程序（腺病毒、人博卡病毒、RSVA、RSVB、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人偏肺病毒），50℃10min,95℃5min;95℃15s,60℃30s,40个循环。以上述临床分离毒株为阳性质控品，以采样系统病毒培养液为阴性质控品。采用ABIVii7TMrealtimePCR仪检测。

1.6统计学处理

采用SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计学分析。计数资料以例数或百分率表示，不同方法间的比较采用配对χ2检验，Kappa检验分析一致性；门诊和住院两类阳性患者Ct值的比较采用两独立样本非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1检测总体情况

420例患者标本中，XpressFlu/RSV检测阳性213例（50.7%），其中检出单个病原体感染209例（49.8%):FluA61例（14.5%),FluB104例（24.8%),RSV44例（10.5%）；检出两种或以上病原体感染共4例（1.0%），其中FluA+FluB阳性1例（0.2%),FluA+RSV阳性3例（0.7%）。

420例患者标本中，自建RT-qPCR检测到其他呼吸道感染病毒15例（3.6%），分别是鼻病毒10例（2.4%），肠道病毒3例（0.7%），腺病毒+鼻病毒+副流感病毒3型阳性1例（0.2%），人偏肺病毒阳性1例（0.2%）。XpressFlu/RSV和普通PCR测序对这15例患者标本进行FluA、FluB、RSV检测均为阴性。

2.2XpressFlu/RSV检测性能

以任意两种方法结果一致为参考，XpressFlu/RSV总灵敏度为100.0%(95%CI:97.8%～100.0%），总特异度为99.7%(95%CI:99.1%～99.9%），阳性预测值、阴性预测值分别为98.6%(95%CI:95.7%～99.6%）和100.0%(95%CI:99.5%～100.0%）。检测各病原体的灵敏度分别为FluA100.0%(95%CI:93.1%～100.0%),FluB100.0%(95%CI:95.5%～100.0%),RSV100.0%(95%CI:90.4%～100.0%）；特异度分别为FluA100.0%(95%CI:98.7%～100.0%),FluB99.4%(95%CI:97.5%～99.9%),RSV99.7%(95%CI:98.3%～100.0%）；阳性预测值、阴性预测值分别为FluA100.0%(95%CI:93.1%～100.0%）和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%),FluB98.1%(95%CI:92.6%～99.7%）和100.0%(95%CI:98.5%～100.0%),RSV97.9%(95%CI:87.3%～99.9%）和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%）。XpressFlu/RSV检测FluA的结果与参考方法完全一致；FluB和RSV分别有2例和1例XpressFlu/RSV检测为阳性，参考方法为阴性。见表1。

2.3Xpress

Flu/RSV与自建RT-qPCR的比较

420例患者标本中有95例进行了自建RT-qPCR检测。对比分析结果，XpressFlu/RSV与自建RT-qPCR的总阳性符合率、阴性符合率均较高，分别为92.4%(95%CI:82.5%～97.2%）和100.0%(95%CI:97.9%～100.0%），一致性强，Kappa值为0.949(P<0.001）。两种方法检测各病原体的Kappa值如下：FluA0.957(P<0.001),FluB0.876(P<0.001),RSV0.978(P<0.001），其中两种方法检测FluB的一致性低于另外两种病原体，见表2。

表1XpressFlu/RSV诊断结果（n)

表2XpressFlu/RSV与自建RT-qPCR结果一致性分析

2.4门诊和住院检测阳性患者Ct值的比较

经XpressFlu/RSV共检测出阳性患者213例，包括27例住院患者，186例门诊患者，门诊和住院两类患者的Ct值进行两独立样本非参数检验，差异有统计学意义(P=0.005）。

3、讨论

呼吸道感染发病率极高，病原体种类繁多，引起的呼吸道感染临床表现相似。明确病原体，对于避免滥用抗菌药物[16]，及早开展针对性的抗病毒治疗，把握治疗时机，判断预后具有重要意义。

GeneXpert?快速分子诊断平台对标本制备和RT-PCR过程进行了全自动化。基于该技术平台开发的检测项目目前以单项PCR为主，如金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌及利福平耐药性检测等[17,18,19]。XpressFlu/RSV为三重PCR检测，标本用量少，检测快速（34min完成），整个过程在封闭试剂盒中进行，极大程度减少了污染的风险，自动化程度高，随到随检，可实现床边和急诊实验室检测，为临床筛查或病原学诊断提供了较好的选择。

经临床标本评估发现，以XpressFlu/RSV、普通PCR测序和自建RT-qPCR任意两种方法结果一致为参考，XpressFlu/RSV与参考方法一致性较高，但检测FluB和RSV出现3例假阳性结果，可能由于XpressFlu/RSV检测过程中存在核酸污染或非特异性扩增导致。由于普通PCR测序方法灵敏度一般低于荧光PCR法，普通PCR测序检测RSV的检测限为100.0TCID50/mL;XpressFlu/RSV对两种RSVA毒株和两种RSVB毒株的检测下限均≤2.3TCID50/mL。自建RT-qPCR法检测灵敏度与XpressFlu/RSV接近，不同之处在于单重检测，手工提取核酸。比较这两种方法的检测结果发现，XpressFlu/RSV与自建RT-qPCR一致性好。以上对比试验中FluA、FluB和RSV的阴性预测值、阴性符合率均高达100.0%，表明XpressFlu/RSV灵敏度高，假阴性结果或漏检率低，适合用于呼吸道感染病毒初筛；虽然存在假阳性结果，但概率低，具有较高检测性能。

国内学者将XpressFlu/RSV与中国食品药品监督管理局批准的RT-qPCR进行比较，3种病毒检测的一致性为94.7%～99.1%,XpressFlu/RSV检测FluA的灵敏度、特异度分别为100.0%、98.6%，检测FluB的灵敏度、特异度分别为100.0%、99.2%,RSV灵敏度、特异度分别为90.5%、99.7%[20]，对XpressFlu/RSV检测性能的评价与本研究结果相似，但RSV灵敏度比本研究稍低，原因可能是入选的受试者比例的差异，本研究住院患者较少（9.8%），上述研究住院患者（77.8%）所占比例较大，而住院患者RSV检出率更高[3]。国外有研究将XpressFlu/RSV与美国疾病预防控制中心研发的RT-qPCR检测结果进行比较，检测FluA的灵敏度和特异度分别为98.6%、99.3%；检测FluB的灵敏度和特异度分别为97.9%、99.4%；检测RSV的灵敏度和特异度分别为98.1%、99.4%[21]，与本研究结果接近。综合分析国内外相关研究[20,21,22,23]，虽参考方法不同，对XpressFlu/RSV的检测性能评价基本一致。XpressFlu/RSV已在美国和欧洲批准上市，在我国于2019年批准，尚未推广，XpressFlu/RSV对我国检出率较高，以及在呼吸道感染病毒占比较大的Flu和RSV检测性能较高[24,25]，具有较好应用前景。

检测Ct值与病毒载量呈线性相关，有研究对XpressFlu/RSV检测的Ct值与不同类别受试者的关联进行了探索，住院患者由于病程较长，检测时病毒载量一般低于处于感染急性期的门诊患者[20]。本研究比较了住院患者（27例）和门诊患者（186例）的Ct值，差异有统计学意义（P=0.005），提示门诊患者较住院者更易获得阳性检测结果。

本研究存在一定局限，合并感染和其他病原体感染标本的数量较少，且经自建RT-qPCR检测的标本数较少，故缺少更有力的统计学数据；研究时间跨度较小，检测标本均在2018年冬春流感季采样，仅一个中心的数据，时间和空间的代表性不足，有待更多实践来验证其临床应用性能。

4、结论

XpressFlu/RSV检测性能好，自动化程度高，使用方便、快捷，是流感流行期大规模人群筛查和呼吸道感染病毒感染病原学诊断的良好选择。

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