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3种呼吸道病毒检测方法在呼吸道感染老年患者中的应用比较

2021-09-27 154 上传者：管理员

摘要：目的比较呼吸道病毒抗原、抗体检测及二者联合检测在呼吸道感染老年患者中的临床应用价值。方法收集2019年1-12月该院收治的呼吸道感染老年患者的血清和鼻咽拭子,利用直接和间接免疫荧光法分别检测呼吸道病毒的抗原和抗体IgM,对比分析抗原、抗体及其联合检测的阳性率,并分析患者性别、年龄、病程对其检测结果的影响。结果725例患者中抗原检测、抗体检测、联合检测的总阳性率分别为36.0%、27.0%、42.9%,3种检测方法的总阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同病程患者抗原检测、抗体检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。发病≤2d、发病3～4d、发病5～6d患者抗原检测阳性率均高于抗体检测阳性率(P<0.05),但其联合检测阳性率与抗原检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05);发病≥7d患者联合检测阳性率明显高于抗原、抗体检测阳性率(P<0.05)。结论呼吸道感染老年患者发病早期呼吸道病毒抗原检测优于抗体检测,与抗原检测相比,抗原、抗体联合检测没有明显提高阳性率;抗原、抗体联合检测可以显著提高发病≥7d患者呼吸道病毒检出阳性率。

关键词：
呼吸道病毒
抗体
抗原
老年
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呼吸道病毒是呼吸道感染最为常见的病原微生物，是导致临床发病率与病死率高的主要原因之一。老年人由于呼吸系统形态学的变化及身体机能的退化，成为呼吸道病毒的易感人群。因此快速检测鉴别呼吸道病毒，对于患者疾病的诊断及治疗具有重要价值。目前检测呼吸道病毒的方法有病毒培养法、分子生物学方法、免疫学方法。病毒培养法耗时耗力，假阴性多；分子生物学的方法灵敏度高，但对工作人员和实验室要求均较高；免疫学的方法相对简单，应用比较广泛。本研究分析呼吸道感染老年患者呼吸道病毒抗原、抗体检测及其两者联合检测的结果，旨在比较3种检测方法的临床应用价值，为临床选择合适的检测方法提供参考。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2019年1-12月本院收治的呼吸道感染的老年患者(≥60岁)725例作为研究对象。其中男394例、女331例，平均年龄(75.36±7.82)岁。研究对象按照年龄分为60～<80岁542例和≥80岁183例。又依据研究对象起病时长分为发病≤2d112例、发病3～4d147例、发病5～6d208例、发病≥7d258例。诊断标准参照人民卫生出版社《内科学(第8版)》。

1.2仪器与试剂

抗体检测试剂盒为西班牙VIRcell公司呼吸道病原体IgM抗体检测试剂盒，抗原检测试剂盒为美国DiagnosticHybrids公司呼吸道病毒检测试剂盒，显微镜为德国徕卡公司LeicaDM500荧光显微镜。

1.3方法

1.3.1标本采集

研究对象入院立即采集鼻咽拭子和血清标本。鼻咽拭子采集方法：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻伸入患者的鼻咽部，停留片刻缓慢旋转取出，将拭子头进入到含2mL生理盐水的无菌容器中，立即送检，用于检测流感病毒A(IFA)、流感病毒B(IFB)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(包括1、2、3型，PIV-1、2、3)抗原。血清标本采集方法：抽取患者静脉血2～3mL于黄色真空促凝管中，3000r/min离心10min,分离血清用于检测呼吸道病毒抗体IgM。

1.3.2呼吸道病毒抗原的检测

(1)标本准备：将标本放在漩涡混匀器上充分混匀10～15s,3000r/min离心5min,弃上清液，在沉淀中加2mL磷酸盐缓冲液(PBS),充分振荡混匀10s再次离心弃上清液，在沉淀中加1mLPBS,吹打混匀形成细胞悬液。(2)标本检测：在8孔载玻片的每孔内滴加25μL的细胞悬液，待完全风干，于室温用预冷的100%丙酮固定细胞约5～10mL后取出风干，在固定并风干好的细胞及抗原对照板上滴加1滴DFA染色试剂，使其完全覆盖细胞并置于湿盒，放入37℃恒温箱孵育30min,用预先稀释好的洗涤液反复清洗已染玻片2～3次，晾干后在固定有细胞的每个孔内加1滴封闭液，最后盖上盖玻片在荧光显微镜下观察，若细胞呈现苹果绿荧光为阳性，无绿色荧光为阴性。

1.3.3呼吸道病毒抗体IgM检测

(1)标本准备：先将血清用预先配置好的PBS按1∶1稀释，即15μL血清加入15μLPBS,再加入150μL抗人IgG吸附剂，混匀后，12000r/min离心10min,留上清备用。(2)标本检测：在载玻片的每孔中加入15μL上述处理好的血清后放入湿盒，37℃温育90min,用PBS冲洗载玻片，然后将载玻片浸泡在PBS中10min,再用去离子水冲洗载玻片晾干后，每孔加入15μL抗人IgMFITC结合物溶液，将载玻片放入湿盒37℃温育30min,重复上述洗涤步骤，待载玻片晾干后，每孔加1滴封闭介质，盖好盖玻片在荧光显微镜下观察，若细胞有果绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0软件进行统计分析，计数资料用百分数(%)表示，率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.13种方法检测呼吸道病毒的阳性情况

725例老年患者中，抗原检测方法检出261例至少1种病毒阳性，阳性率为36.0%,其中检出2种及以上病毒阳性24例，混合感染率9.20%;抗体检测方法检出196例至少1种病毒阳性，阳性率为27.0%,其中检出2种及以上病毒阳性29例，混合感染率14.8%;抗原联合抗体检测方法检出311例至少1种病毒阳性，阳性率为42.9%,其中检出2种及以上病毒阳性35例，混合感染率11.3%。差异有统计学意义(χ2=13.5、7.22、40.1,P<0.05)。抗原检测阳性率最高为IFB,其次为IFA、PIV、RSV、ADV,另外两种检测方法也显示同样的趋势，见表1。

2.2不同性别、年龄患者3种检测方法阳性率比较

男、女患者抗原检测阳性率、抗体检测阳性率、联合检测阳性率比较差异均无统计学意义(χ2=1.48、0.85、1.46,P>0.05)。两个年龄段间抗体检测阳性率比较差异有统计学意义(χ2=4.25,P<0.05),抗原检测阳性率、联合检测阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.61、0.01,P>0.05),见表2。

2.3不同病程患者3种检测方法阳性率比较

不同病程患者抗原检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),随着病程的延长抗原检测阳性率呈降低趋势。不同病程患者抗体检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),随着病程的延长抗体检测阳性率呈下降趋势。不同病程患者联合检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。发病≤2d、发病3～4d、发病5～6d患者3种检测方法阳性率比较差异有统计学意义(χ2=31.39、15.20、6.89,P<0.05),进一步分析结果显示发病≤2d、发病3～4d、发病5～6d患者抗原检测阳性率均高于抗体检测阳性率(χ2=23.60、9.72、4.31,P<0.05),联合检测阳性率亦均明显高于抗体检测阳性率(χ2=27.37、15.67、6.54,P<0.05),联合检测阳性率与抗原检测阳性率比较差异均无统计学意义(χ2=0.16、0.35、0.49,P>0.05)。发病≥7d患者3种检测方法阳性率比较差异有统计学意义(χ2=10.80,P<0.05),其联合检测阳性率明显高于抗原、抗体检测阳性率(χ2=10.47、4.01,P<0.05),但其抗原检测阳性率与抗体检测阳性率比较差异无统计学意义(χ2=1.55,P>0.05),见表3。

3、讨论

目前，抗原或抗体检测是临床上常用的呼吸道病毒检测方法，其中直接免疫荧光法是经世界卫生组织评审结果良好，是稳定可靠的抗原检测方法[4],间接免疫荧光测抗体的方法也有着较高的特异度和灵敏度等优点[5]。本研究比较这两种检测方法的阳性率结果，分析是否有必要联合检测来提高病原体检出阳性率。这对于指导临床更加快速、合理地明确诊断，减少住院周期及不必要的实验室检测，节约医疗资源有着重要意义。

本研究结果显示，抗原检测、抗体检测、抗原及抗体联合检测总阳性率分别为36.0%、27.0%、42.9%。从总阳性率来看，联合检测阳性率高于抗原、抗体单独检测，抗原检测阳性率高于抗体检测阳性率，提示总体上抗原、抗体联合检测有助于提高阳性率，具体还需进一步分析。老年人群呼吸道病毒感染以IFB为主，其次为IFA、PIV、RSV、ADV,这与潘婧等[6]报道结果不同，可能与地域、年份不同有关[7,8,9]。3种方法检测混合感染率约10%,高于高巍[10]报道结果，提示老年人更容易发生呼吸道病毒的混合感染。

本研究结果显示，男、女患者抗原阳性率、抗体阳性率、联合检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。60～<80岁患者抗体检测阳性率明显高于≥80岁患者，可能跟≥80岁老年人的免疫反应明显降低有关[11]。发病≤2d、发病3～4d和发病5～6d患者抗原检测、联合检测阳性率均明显高于抗体检测阳性率，但其联合检测阳性率与抗原检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05),进一步提示在发病早期抗原检测优于抗体检测，这可能与抗体产生的窗口期有关[12];与抗原检测相比，联合检测并没有显著提高病原体检出阳性率。发病≥7d患者联合检测阳性率明显高于抗原、抗体检测阳性率，而其抗原检测阳性率与抗体检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),提示发病≥7d患者联合检测有助于提高呼吸道病毒检出阳性率。