首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 呼吸内科论文 > 宏基因组二代测序在免疫功能低下宿主肺炎诊断中的研究

宏基因组二代测序在免疫功能低下宿主肺炎诊断中的研究

2024-03-13 115 上传者：管理员

摘要：目的观察免疫功能低下宿主肺炎(ICHP)患者的临床特征，探讨肺泡灌洗液宏基因组二代测序(mNGS)对ICHP的诊断价值。方法 2021年6月—2023年6月河南省人民医院诊治ICHP患者55例，均行支气管镜检查及肺泡灌洗液mNGS、传统病原微生物检测(CMT),记录病原体检出情况，比较mNGS、CMT的病原体检出率。55例患者中双肺多发病变37例，根据双肺是否有弥漫性磨玻璃影分为弥漫组18例和非弥漫组19例，比较2组病原体检出情况。结果 55例患者中检出真菌37例，其中霉菌20例，耶氏肺孢子菌22例；检出细菌30例，其中肺炎克雷伯菌7例，铜绿假单胞菌7例，金黄色葡萄球菌4例，肺炎链球菌2例，分枝杆菌属6例，惠普尔养障体2例，诺卡菌2例；检出病毒38例，其中巨细胞病毒18例，EB病毒21例，新型冠状病毒7例，人类疱疹病毒1型4例，流感病毒2例；混合感染43例。55例患者中肺泡灌洗液mNGS检出病原体49例，CMT检出19例，2种方法同时检出13例；肺泡灌洗液mNGS对ICHP患者的病原体检出率(89.1%)高于CMT(34.5%)(χ2=9.720,P=0.002)。弥漫组耶氏肺孢子菌检出率(61.1%)高于非弥漫组(26.3%)(χ2=4.560,P=0.033),霉菌、细菌、病毒检出率与非弥漫组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论肺泡灌洗液mNGS对ICHP患者病原体的检出性能优于CMT,联合CMT检出性能更佳；ICHP患者出现双肺弥漫性磨玻璃影时需警惕耶氏肺孢子菌感染。

关键词：
ICH
免疫功能低下宿主肺炎
宏基因组二代测序
耶氏肺孢子菌
肺泡灌洗液
加入收藏

随着器官移植、细胞毒性治疗、靶向生物疗法等的应用，免疫功能低下宿主(immunocompromised host, ICH)人群逐渐增多，感染风险明显增加，致病菌种类更加复杂[1]。感染是影响ICH预后的重要因素，肺是感染的主要靶器官[1,2]。目前ICH肺炎(ICH pneumonia, ICHP)的诊断标准尚无定论。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是新兴的病原学检测方法，可弥补传统病原学检测方法检出率低、检测周期长的缺点[3]。本研究观察ICHP患者的临床特征，探讨肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)mNGS对ICHP的诊断价值，报道如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

2021年6月—2023年6月河南省人民医院诊治ICHP患者55例，男34例，女21例；年龄62(56,67)岁；吸烟0(0,440)支年。纳入标准：(1)根据文献[4]选择ICH人群：恶性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、慢性免疫抑制和应用新型生物制剂、先天免疫缺陷患者及造血干细胞移植受者、实体器官移植受者；(2)符合文献[4]中ICHP诊断标准：发生在ICH个体上的感染性肺炎；对已知存在免疫低下患者，不论是否存在肺炎的症状体征，当胸部CT检查提示新发浸润影或浸润影加重，且检测到可能致病菌，可诊断为ICHP;对事先未知是否存在免疫低下患者，当检测到机会致病菌后，胸部CT检查提示新发浸润影或浸润影加重，且经评估存在免疫缺陷，可诊断为ICHP。排除标准：(1)既往有免疫抑制病史者；(2)病原学标本非BALF者；(3)未同时行BALF mNGS和传统病原微生物检测(conventional microbiological test, CMT)者；(4)无同步胸部CT检查者。本研究经河南省人民医院医学伦理委员会批准通过，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集

收集患者临床资料，包括基本信息、基础疾病、临床症状、血常规、生化指标、C反应蛋白、巨细胞病毒核酸定量检测、EB病毒核酸定量检测、流感病毒核酸检测、新型冠状病毒核酸检测、病原体抗体联合检测、血培养、呼吸道标本培养、G试验和GM试验、淋巴细胞免疫分析、免疫球蛋白水平、自身抗体谱、胸部CT检查结果等。

1.2.2 胸部CT检查

应用Revolution CT机(美国GE公司)。患者取仰卧位，双臂上举，先摄取胸部正位定位像，扫描范围为肺尖至肋膈角，扫描层厚5 mm, 重建1 mm, 最大管电流740 mA,256排螺距，观察双肺是否有异常浸润影、弥漫性磨玻璃影(双肺出现弥漫性边界模糊或清楚的半透明密度区，其内可见血管纹理和支气管壁的影响改变)。55例患者中双肺多发病变37例，根据双肺是否有弥漫性磨玻璃影分为弥漫组18例和非弥漫组19例，比较2组病原体检出情况。

1.2.3 BALF采集与送检

患者均行支气管镜检查，根据气管镜BALF标准操作流程[5],于病灶叶段留取BALF标本(胸部CT检查提示双肺弥漫性病变时，选择右肺中叶或左肺舌段进行灌洗)。标本采集后分别行mNGS和CMT(包括革兰染色涂片、培养、GM试验、特殊染色等)。

1.2.4 mNGS检测

采用IDseqTMUltra病原捕获宏基因检测技术(广州微远基因科技有限公司)和多重病原体检测技术(南京实践医学检验有限公司)。取600 μL BALF,提取DNA;构建DNA文库，待测核酸引入特异性标签序列，应用建库试剂盒(广州微远基因科技有限公司)(Qsep1和Qubit)和Nextseq 550Dx测序仪(美国Illumina公司)测序或使用一步法DNB制备试剂盒和MGISEQ-200基因测序仪(深圳华大智造科技股份有限公司)测序；去除低质量、过短序列，与微生物大数据库进行比对，进行数据分析。

1.2.5 病原学检测结果判定

mNGS阳性标准[6]:分析报告质量，判断结果可信度，并对mNGS检出微生物进行分级；根据临床特征，结合mNGS微生物分级进行临床决策，必要时进行多学科会诊。CMT阳性判定标准：(1)血培养、下呼吸道标本培养、胸腔积液培养阳性；(2)鼻咽或口咽拭子、下呼吸道标本PCR检测病毒阳性；(3)组织病理学或直接镜检到真菌，有组织损害证据；(4)非典型病原体或病毒血清IgM抗体由阴性转为阳性，或急性期和恢复期双份血清特异性IgG抗体滴度呈4倍及4倍以上变化。符合以上4项中任意1项即可判断为阳性。

1.3 统计学处理

应用SPSS 26.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，非正态分布计量资料以中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]表示；计数资料比较采用χ2检验或校正χ2检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 临床资料

55例患者中恶性肿瘤28例，慢性免疫抑制和应用新型生物制剂22例，实体器官移植受者4例，先天性免疫缺陷1例。首发症状为发热24例，咳嗽17例，呼吸困难18例。合并糖尿病14例，高血压18例，冠心病4例，慢性阻塞性肺疾病4例，支气管哮喘1例，脑血管病4例，低蛋白血症44例。实验室检查示白细胞计数5.9(3.6,9.1)×109/L,中性粒细胞计数4.0(2.4,6.7)×109/L,淋巴细胞计数0.9(0.5,1.3)×109/L,血白蛋白(31.1±4.5)g/L,C反应蛋白31.8(12.7,88.7)mg/L。胸部CT检查提示以双肺多发病变为主37例，主要表现为双肺多处异常浸润影；以局部病变为主18例，主要表现为病灶局限于某一肺叶或肺段。见图1。

图1 ICHP患者胸部CT影像图

2.2 病原体检出情况

55例患者中检出真菌37例，其中霉菌20例，耶氏肺孢子菌22例；检出细菌30例，其中肺炎克雷伯菌7例，铜绿假单胞菌7例，金黄色葡萄球菌4例，肺炎链球菌2例，分枝杆菌属6例(结核分枝杆菌5例，脓肿分枝杆菌1例),惠普尔养障体2例，诺卡菌2例；检出病毒38例，其中巨细胞病毒18例，EB病毒21例，新型冠状病毒7例，人类疱疹病毒1型4例，流感病毒2例；混合感染43例。

2.3 BALF mNGS与CMT病原体检出率比较

55例患者中BALF mNGS检出病原体49例，CMT检出19例，2种方法同时检出13例。BALF mNGS对ICHP患者的病原体检出率(89.1%)高于CMT(34.5%)(χ2=9.720,P=0.002)。见表1。

表1 BALF mNGS与CMT病原体检出率比较

2.4 弥漫组与非弥漫组病原体检出率比较

弥漫组耶氏肺孢子菌检出率高于非弥漫组(P<0.05),霉菌、细菌、病毒检出率与非弥漫组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 弥漫组与非弥漫组病原体检出率比较

3、讨论

目前关于ICHP患者规范化诊疗的临床研究较少，ICH人群的异质性及ICHP缺乏统一诊断标准导致较多临床研究在设计时即排除ICHP患者[7,8]。2023年美国胸科协会ICH的定义中将糖尿病、慢性肝病、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病等视为合并症，尽管该类人群患肺炎风险增加，但不被视为ICH,与既往检出不常见致病菌者即视为ICH的观点不同[9]。因此，既往关于ICHP的研究人群范围可能被扩大，无法真实反映ICHP的临床特征[10]。本研究纳入的ICH人群主要为恶性肿瘤、慢性免疫抑制和应用新型生物制剂、实体器官移植受者等，可真实反映ICHP患者的临床特征。CMT存在耗时长、需预先假定病原体等缺点，mNGS有病原体检出率高、对病原谱检测全面的优势。本研究观察ICHP患者的临床特征，分析BALF mNGS对ICHP的诊断价值，可为临床ICHP的诊疗提供参考。

由于免疫功能缺陷，ICHP患者常缺乏典型临床体征，但病情进展快，短时间内可能进展为重症。因此，及时、准确地检测致病菌是治疗的关键。采用mNGS进行病原学检测可提供更多诊断依据，指导临床治疗。本研究结果显示，55例ICHP患者中检出真菌37例，其中霉菌20例，耶氏肺孢子菌22例；检出细菌30例，其中肺炎克雷伯菌7例，铜绿假单胞菌7例，金黄色葡萄球菌4例，肺炎链球菌2例，分枝杆菌属6例，惠普尔养障体2例，诺卡菌2例；检出病毒38例，其中巨细胞病毒18例，EB病毒21例，新型冠状病毒7例，人类疱疹病毒1型4例，流感病毒2例；病原体检出较多的是耶氏肺孢子菌、霉菌、巨细胞病毒、EB病毒，其中混合感染43例，多为真菌+病毒、多种真菌、多种病毒、真菌+细菌+病毒模式。根据ICH的社区获得性肺炎初始治疗策略指南[9],建议初始经验性治疗除覆盖呼吸道核心致病菌外，还需个体化涵盖机会致病菌，如耶氏肺孢子菌、霉菌、诺卡菌、巨细胞病毒等。

mNGS可提高感染性疾病的诊断效率，优化治疗决策。有研究[11]发现，BALF mNGS对ICHP患者致病菌的检出率(90.5%)高于培养阳性(38.1%),对厌氧菌和苛求菌的检出更有优势，提示BALF mNGS有助于减少漏诊，促进精准治疗，但 BALF mNGS结果解释需结合临床综合判断。本研究结果显示，55例患者中BALF mNGS检出病原体49例，CMT检出19例，2种方法同时检出13例；BALF mNGS对ICHP患者病原体的检出率高于CMT,表明BALF mNGS对ICHP患者病原体检出性能优于CMT。CMT检出率较低可能与标本质量、部分为厌氧菌、已应用抗生素、培养周期长等有关。研究[12]发现，mNGS对免疫缺陷肺部感染患者病原体的检出率(94.9%)高于CMT(64.1%),对耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒的检出率(41.0%、37.2%)均高于CMT(1.3%、7.7%);根据mNGS病原学结果抗感染治疗策略调整率为87.2%;提示与CMT相比，ICHP患者采用mNGS在诊断阳性率、混合感染诊断率、病原体检出率及指导抗感染治疗策略调整方面更具优势。BALF mNGS的诊断性能因病原体类型不同而不同，对未知或罕见病原体的诊断有较大优势[13]。但Peng等[14]比较BALF mNGS与CMT对60例疑似肺炎的免疫功能低下重症患者病原体的诊断效能，结果发现BALF mNGS和CMT对细菌和病毒感染的诊断准确率相当，尽管BALF mNGS可识别更多病毒性肺炎，但对真菌感染的诊断准确率(76.7%)较CMT(99.2%)低，可能是由于BALF mNGS对侵袭性肺曲霉菌病的灵敏度(45.5%)较CMT(100.0%)低，且BALF mNGS检出条件致病菌的解读需综合考虑测序数据和临床因素，以避免过度诊断或诊断不足。因此，mNGS与CMT联合检测的诊断性能更佳。

有双肺弥漫性磨玻璃影的ICHP患者需警惕耶氏肺孢子菌感染，但其CMT结果常为阴性。mNGS可快速检测真菌感染的病原体，提高重症肺炎患者病原学诊断的灵敏性[15]。本研究结果显示，弥漫组耶氏肺孢子菌检出率高于非弥漫组，表明BALF mNGS对有双肺弥漫性磨玻璃影的ICHP患者耶氏肺孢子菌检出性能优于CMT。此外，mNGS结果还有助于指导抗感染治疗、评估治疗效果、预测预后等。Zhang等[10]研究发现，mNGS可缩短重症ICHP患者病原体检测时间和ICU住院时间，提高病原体检出率、混合感染检出率、有效阳性率和抗生素治疗调整率，降低60 d病死率；mNGS是预测重症ICHP患者预后的重要方法，尤其是影像学提示双侧弥漫性病变的ICHP患者。

本研究结果提示，BALF mNGS对ICHP患者病原体的检出性能优于CMT,联合CMT检出性能更佳；ICHP患者出现双肺弥漫性磨玻璃影时需警惕耶氏肺孢子菌感染。但本研究为单中心研究、样本量小、未纳入重症患者、未进行疾病严重程度评分，尚需扩大样本量、评估疾病严重程度、进行多中心研究进一步证实。

参考文献:

[3] 陆晓旻,朱际平,陈扬,等.基于宏基因组二代测序诊断的鹦鹉热衣原体肺炎的流行病学特征分析[J].中国临床研究,2022,35(1):1-5.

[5]中华医学会呼吸病学分会.肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2017,40(8):578-583.

[6]中华医学会呼吸病学分会.下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2023,46(4):322-335.

[7]中华医学会呼吸病学分会.中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2016,39(4):253-279.

[8]中华医学会呼吸病学分会感染学组.中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2018,41(4):255-280.

[11]叶开婷,尤青海.宏基因二代测序在免疫低下宿主中肺炎诊断价值的研究[J].临床肺科杂志,2022,27(8):1186-1190.

[12]段智梅,沈志勇,胡晔,等.宏基因组高通量测序在免疫缺陷患者肺部感染诊断与治疗中的应用价值[J].中华医学杂志,2023,103(25):1885-1891.

[15]贾建超,贾建敏,刘姿,等.宏基因组学二代测序技术对重症肺炎真菌感染诊断价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(10):1023-1025.

基金资助:河南省科技攻关计划项目(182102310549);

文章来源:况红艳,蒋亚芬,赵志刚等.宏基因组二代测序在免疫功能低下宿主肺炎诊断中的价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(03):275-279.