肺结核是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性消耗性传染疾病，主要侵犯肺部，也可累及全身器官和系统[1]。资料显示，全球现存活动性肺结核患者超1 000万人，年病死人数超过150万，已成为全球第10大死亡原因[2,3]。目前肺结核的治疗主要依赖于抗结核药物，但由于药物耐受性差、副作用大、用药不规范等原因，导致耐多药肺结核的出现和流行。耐多药肺结核患者通常仅能使用二线药物(如氟喹诺酮类、氨基糖苷类等)治疗，效果较差、疗程长、毒性大、价格昂贵，且可能出现更为广泛的耐药性[4]。因此，耐多药肺结核已成为全球公共卫生领域的重大挑战之一。肠道菌群与机体健康密切相关，参与营养代谢、免疫调节、病原体防御等多种生理功能，正常情况下肠道菌群保持动态平衡，当肠道菌群失衡时会影响宿主的生理功能和健康状态。研究显示，肠道菌群可通过代谢产物、免疫细胞、神经信号等途径影响肺部的微环境和免疫应答，与肺结核的发生有关，且可影响复治患者的耐药性[5]。但关于初诊肺结核患者肠道菌群变化及其与耐多药性关系的研究尚需要进一步探讨。本研究比较健康受试者与初诊肺结核患者肠道菌群属水平的相对丰度差异，并分析肠道菌群改变及其与耐多药的临床关系，以期为该类患者的治疗提供一些启示，现报道如下。

1、资料与方法

1.1 研究资料

初诊肺结核患者耐多药的影响因素分析的样本量预估：经预试验，120例初诊肺结核患者耐多药率22.50%(27/120),预估选取初中及以下文化程度、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、结核病接触史、肺结核空洞病灶数量、治疗过程中断、双歧杆菌属、Shannon指数共7个影响因素，由于耐多药例数为影响因素个数的10～15倍[6],因此初诊肺结核患者耐多药患者为70～105例，总样本量312～467例，假设脱落率为10%,总样本量为347～519例。选取2021年6月至2023年5月本院收治的初诊肺结核患者347例，纳入肺结核组。男201例，女146例；年龄19～75岁，平均(43.48±10.05)岁；体质量指数(body mass index, BMI)17.52～29.36 kg·m-2,平均(23.20±2.29)kg·m-2。纳入标准：(1) 符合《肺结核基层诊疗指南(2018年)》中肺结核诊断标准[7],痰涂片培养MTB阳性，胸部影像学检查显示肺结核特征性改变；(2) 初治患者；(3) 年龄>18岁；(4) 精神正常，可配合研究。排除标准：(1) 合并肺癌、肺真菌感染、非结核分枝杆菌感染等其他肺部感染或疾病；(2) 合并艾滋病、系统性红斑狼疮等其他免疫缺陷或自身免疫性疾病；(3) 近半年内服用过激素类药物或其他免疫抑制药物；(4) 对抗结核药物有过敏反应或不耐受；(5) 孕妇或哺乳期妇女。另选取同期于本院体检的健康受试者347例，纳入健康组。男205例，女142例；年龄18～76岁，平均(43.59±9.97)岁；BMI 17.12～29.86 kg·m-2,平均(23.25±2.36)kg·m-2。肺结核组与健康组性别、年龄及BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。受试者均签署书面同意书。

1.2 方法

1.2.1 16S rRNA基因测序技术检测肠道菌属相对丰度

治疗前收集患者粪便样本0.5 g, 置入含有裂解缓冲液和蛋白酶K的管中，放入珠磨仪中机械破碎，以充分释放出脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)。将裂解后的样品离心，取上清移至新管中，加入InhibitEX Buffer缓冲液去除多糖、胆酸盐等抑制剂。将去除抑制剂后的样品移至含有硅胶膜的管中，使DNA特异性地结合到固相载体上，用洗涤缓冲液洗涤柱或管去除残留污染物，用洗脱缓冲液将DNA从柱或管中洗脱出来，用紫外分光光度计测定纯化后的DNA,确保其完整性和纯度。使用通用引物对16S rRNA基因的V3～V4区域进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国Qiagen公司)纯化PCR产物。使用Qubit 2.0荧光定量仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定PCR产物的浓度，使用Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent Technologies公司)检测PCR产物的质量。将合格的PCR产物进行文库构建，使用Illumina MiSeq平台进行高通量测序。使用QIIME 2软件进行数据分析，包括质量控制、聚类、物种注释、多样性分析、差异分析等。将获取的代表序列与已有的微生物数据库进行对比获取菌属的相对丰度，并计算Observed species指数、Shannon指数。Observed species指数对群落中每个物种的丰度进行计数，然后求和。Shannon指数计算公式：H=sumi=1sPilnPi,其中s是群落中的物种总数，Pi是第i个物种占所有物种的比例。

1.2.2 一般资料收集

收集患者一般资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、文化程度、民族、居住地、家庭人均收入、婚姻状况、高血压、糖尿病、冠心病、COPD、结核病接触史、咯血、肺结核空洞病灶数量、治疗过程中断。

1.2.3 MTB菌株耐多药检测

根据《中国结核病预防控制工作技术指南》[8],初治肺结核患者在治疗3个月后进行药物敏感性试验。从患者中分离并鉴定312株MTB,菌株无重复收集，痰液标本205份，支气管肺泡灌洗液标本107份。根据《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》采用绝对浓度法进行药敏试验[9],细菌在利福平浓度40～50 μg·mL-1的培养基上可存活判定为利福平耐药，在异烟肼浓度>0.2 μg·mL-1的培养基上可存活判定为异烟肼耐药，在吡嗪酰胺浓度>32 μg·mL-1的培养基上可存活判定为吡嗪酰胺耐药，在乙胺丁醇浓度>5.0 μg·mL-1的培养基上可存活判定为乙胺丁醇耐药，在链霉素浓度>8.0 μg·mL-1的培养基上可存活判定为链霉素耐药。耐多药是指MTB菌株对上述至少2种药物同时产生耐药性。将耐多药患者纳入耐多药组，其余纳入非耐多药组。

1.3 统计学处理

用SPSS 23.0软件分析数据。计数资料以n(%)表示，用χ2检验；符合正态分布的计量资料以

表示，用t检验；不符合正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，用Mann- Whitney U检验；用Logistic回归模型分析初诊肺结核患者耐多药的影响因素。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肺结核组、健康组肠道菌群属水平的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数比较

与健康组比较，肺结核组丁酸单胞菌属、类杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、布劳特菌属、梭状芽孢杆菌属的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数降低(P<0.05),肠球菌属、粪球菌属、多尔菌属、志贺菌属、小杆菌属、韦荣球菌属、瘤胃球菌属的相对丰度升高(P<0.05)。见表1、图1。

表1 肺结核组、健康组肠道菌群属水平的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数比较

图1 肺结核组和健康组肠道菌群属水平相对丰度热图

2.2 耐多药组、非耐多药组一般资料比较

347例患者脱落35例(主动退出12例，主动放弃治疗14例，失访9例),其余312例初诊肺结核患者耐多药72例(23.08%),纳入耐多药组，其余240例纳入非耐多药组。与非耐多药组比较，耐多药组初中及以下文化程度、家庭人均收入<3 000 元·月-1、COPD、结核病接触史、治疗过程中断构成比升高(P<0.05),肺结核空洞病灶数量增加(P<0.05)。见表2。

2.3 耐多药组、非耐多药组肠道菌群属水平的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数比较

与健康组比较，肺结核组双歧杆菌属的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数降低(P<0.05)。耐多药组和非耐多药组各指标比较见表3、图2。

2.4 初诊肺结核患者耐多药的影响因素分析

对文化程度(高中及以上=0,初中及以下=1)、家庭人均收入(≥3 000元·月-1=0,<3 000 元·月-1=1)、COPD(否=0,是=1)、结核病接触史(否=0,是=1)、治疗过程中断(否=0,是=1),肺结核空洞病灶数量、双歧杆菌属相对丰度、Observed species指数、Shannon指数(实际值)进行赋值，耐多药(否=0,是=1)为因变量行Logistic回归模型分析。以方差膨胀因子(variance inflation factor, VIF)值>10为排除共线性变量的依据。文化程度与家庭人均收入具有共线性，排除家庭人均收入，保留文化程度，Observed species指数与Shannon指数具有共线性，排除Observed species指数，保留Shannon指数。结果显示，初中及以下文化程度、COPD、结核病接触史、肺结核空洞病灶数量、治疗过程中断、双歧杆菌属相对丰度、Shannon指数是初诊肺结核患者耐多药的影响因素(P<0.05)。见表4。

3、讨论

目前多认为肺结核耐多药可分为非特异性的固有耐药和获得性耐药，固有耐药是由于MTB本身具有的一些特征，如细胞壁的厚度、外排泵的活性、代谢途径的变化等，导致药物难以进入细胞或被排出细胞，获得性耐药是由于MTB染色体上编码相关酶或者靶点蛋白的基因发生突变，导致药物靶标或代谢酶的改变，使药物失去作用[10,11,12]。耐多药肺结核的诊治较普通肺结核更加复杂和困难，治疗周期更长，进一步增加患者放弃治疗或不规范服药的风险，从而导致病情恶化或进展为广泛耐药性肺结核。本研究中初诊肺结核患者耐多药率为23.08%,与张宇琦等[13]报道的21.29%、奚莹等[14]报道的24.24%接近，但低于范大鹏等[15]统计的35.85%,可能与样本量所处地域、生活环境、个体遗传因素等存在差异有关。

表2 耐多药组、非耐多药组一般资料比较

本研究结果显示，肺结核组丁酸单胞菌属、类杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、布劳特菌属、梭状芽孢杆菌属的相对丰度低于健康组，肠球菌属、粪球菌属、多尔菌属、志贺菌属、小杆菌属、韦荣球菌属、瘤胃球菌属的相对丰度高于健康组，提示初诊肺结核患者肠道菌群发生改变，与Wang 等[16]研究结果一致。首次感染MTB时，免疫系统会产生一系列反应来清除感染，可能导致肠道菌群失衡，肠道菌群紊乱又会进一步影响肺部免疫应答，增加肺结核的易感性和进展，加重肺部病理损伤；MTB感染可能会对机体产生一系列反应，使肠道易受细菌感染和感染其他疾病；MTB感染导致肺部功能受损，影响气化和水液代谢，使肠道不得濡养，传导功能失司，从而引起肠道菌群失调。Observed species指数是一种直接反映样本中物种数量的指数，即样本中不同操作分类单元(OTU)的个数，其值越大说明样本中物种越丰富，Shannon指数是一种综合反映样本中物种丰富度和均匀度的指数，其值越大说明样本中物种越多且分布越均匀[17,18]。本研究中肺结核组Observed species指数、Shannon指数低于健康组，提示初诊肺结核患者肠道菌群物种丰富度、均匀度降低。肺结核本身是一种慢性炎症性疾病，会影响机体的免疫系统和代谢平衡，从而改变肠道菌群的组成和功能。此外，有研究发现肺结核患者往往存在营养不良、蛋白质摄入不足、胆固醇水平降低等问题，这些问题会降低肠道菌群产生有益代谢物含量如短链脂肪酸，从而影响肠道菌群平衡、削弱肠道屏障和免疫功能[19]。

表3 耐多药组、非耐多药组肠道菌群属水平的相对丰度及肠道菌群Observed species指数、Shannon指数比较

图2 耐多药组和非耐多药组肠道菌群属水平相对丰度热图

表4 初诊肺结核患者耐多药的非条件Logistic回归模型分析

本研究经Logistic回归模型分析发现，双歧杆菌属相对丰度、Shannon指数是初诊肺结核患者耐多药的影响因素。双歧杆菌是核心的肠道益生菌，可改善肠道微生态平衡，增强免疫力，抑制有害菌的生长，其影响肺结核耐多药的机制可能包括：双歧杆菌可抑制MTB的生长和复制，降低MTB的耐药性，并产生乳酸、醋酸、丁酸等抗菌物质，降低肠道和肺部的pH值，抑制MTB的代谢和呼吸；双歧杆菌可与MTB竞争营养物质和受体位点，阻碍MTB的定植和侵入；双歧杆菌可调节宿主的免疫反应，增强对MTB的清除能力，减少MTB的耐药性；双歧杆菌可刺激肠道和肺部的巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等免疫细胞的活化和分化，促进抗结核免疫因子如干扰素- γ、白细胞介素- 12、白细胞介素- 17等的产生，增强宿主对MTB的杀伤作用，防止MTB在体内持续存在和变异；双歧杆菌可改善宿主对抗结核药物的吸收和代谢，提高抗结核药物的有效性，降低MTB的耐药性，并促进肠道和肺部的血流量和通透性，增加抗结核药物的吸收和分布[20]。肠道微生物多样性与耐药性有着密切的关系，高多样性的肠道微生物群落可能具有更强的稳定性和恢复力，能够抵抗外界干扰，减少耐药菌的定植。Du 等[21]研究发现，肺结核患者的肠道菌群Shannon指数通常低于健康人，且多重耐药肺结核患者的Shannon指数低于单一耐药或敏感型肺结核患者，说明肺结核感染会导致肠道菌群失衡，从而降低其多样性，进而影响宿主的免疫系统和代谢功能，增加肺结核耐药性的风险。但是目前关于肠道菌群Shannon指数与肺结核耐药性关系的研究还不够充分，还需要更多的临床和实验数据来支持和验证。

此外，本研究发现，初中及以下文化程度、COPD、结核病接触史、肺结核空洞病灶数量、治疗过程中断也是初诊肺结核患者耐多药的影响因素，与Bykov 等[22]的研究结论一致。分析原因为：学历低的人群可能缺乏结核病基本知识，不遵循医嘱规范服药，并面临更多的社会经济困难，增加放弃治疗或中断治疗的可能性；COPD患者由于气道阻塞和肺气肿，影响抗结核药物在肺部的分布和浓度，难以达到杀菌效果，且长期使用类固醇、支气管扩张剂等药物使免疫功能低下，导致耐药菌株存活和扩散；当初诊肺结核患者与已感染多重耐药结核菌的患者进行接触时，可能导致多重耐药结核菌感染；空洞内部的低氧、酸性环境会影响抗结核药物的杀菌效果，且空洞中的高密度菌群会增加基因突变和基因转移的概率，导致耐药性的累积和传播；治疗过程中自行停药或间断服药导致已经被抑制的结核菌重新大量繁殖，并产生耐药性和基因突变。

综上所述，初诊肺结核患者肠道菌群发生改变，双歧杆菌属相对丰度、Shannon指数及初中及以下文化程度、COPD、结核病接触史、肺结核空洞病灶数量、治疗过程中断是初诊肺结核患者耐多药的影响因素。根据本研究结论，建议初诊肺结核患者应检测肠道菌群的数量和多样性，并合理使用抗结核药物，同时注意饮食平衡，以改善肠道菌群的结构和功能，或适当使用益生菌制剂或粪菌移植等方法，以调节肠道菌群，抑制肺结核的发展及耐药。此外，应加强初诊肺结核患者的健康教育，增强其防治意识；加强COPD患者的管理和监测，避免COPD对肺结核的不良影响；减少结核病接触史患者的感染风险，加强接触者的筛查和化验，及时隔离，防止耐药菌株传播；优化抗结核药物方案，根据空洞病灶数量选择合适的药物种类和剂量；坚持规范化和个体化的治疗原则，监督患者按时按量服药，避免治疗过程中断或不规范导致的耐药性增加。本研究仍存在一些局限性，如不同地区的微生物组背景差异较大，未来应开展多中心的合作研究，以验证不同地区和人群中肠道菌群与初诊肺结核患者耐多药关系的普遍性和特异性。

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基金资助:三门峡市2021年科技发展计划项目(2021004043);

文章来源:程治军,何多娇,常婧,等.初诊肺结核患者肠道菌群改变及其与耐多药的临床关系分析[J].东南大学学报(医学版),2024,43(03):431-438.