多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)常见于育龄期妇女，发病率约为5%～10%,胰岛素抵抗与高雄激素血症是其重要的两大特征，慢性低度炎症促进PCOS的发生发展，其远期并发症有2型糖尿病、心血管疾病等[1]。与未患PCOS妇女相比，PCOS患者心脑血管意外发生风险增加1.55倍[2]。PCOS以促血栓状态为特征[3]。一项临床随访研究证实，PCOS患者血栓性疾病的总发生率比非PCOS对照组高63%[4]。

血小板是血栓形成的主要细胞，血管内皮损伤后，血小板黏附作用于裸露的胶原表面，黏附的血小板释放出二磷酸腺苷和血栓素A2等促使更多的血小板黏附、聚集形成血小板血栓。血小板通过参与炎症反应、脂质代谢异常及血小板自身活化等途径，在血栓的发生和发展中发挥着重要作用[5]。Riordan在1989年首次克隆出囊性纤维化跨膜电导调节子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR),它基因编码一种cAMP激活的氯离子通道[6]。CFTR单基因突变可引起一种人类遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)。以往研究提示，CF患者外周血小板活性增高[7]。近年有报道应用巨核细胞/血小板特异性敲除CFTR小鼠，证实CFTR敲除可促进血小板介导的炎症反应[8]。血小板活化是血小板介导的免疫炎症早期关键环节，国内外多项研究在内毒素血症、动脉粥样硬化、糖尿病和肿瘤的病理生理过程中均已证实。糖皮质激素诱导蛋白激酶1(serum glucocorticoid-inducible kinase 1,SGK1)在血小板和巨核细胞均有表达，并且与血小板活化、颗粒合成和动脉血栓形成密切相关[9]。SGK1活化主要依赖于磷酸化，已报道的磷酸化位点包括Ser422和Thr256,与血小板功能密切的SGK1磷酸化位点是Ser422。在MEG-01细胞中，当转染入SGK1的激活型突变体S422D后，Ser422位点被激活，进而促进血小板脱颗粒释放和血小板的活化[10]。

多项研究提示，PCOS患者血栓发生风险增高[11],但尚无对PCOS患者的血小板活性及血栓形成相关机制的研究。本课题组既往研究发现，在动物实验中，阻断CFTR氯通道或降低CFTR蛋白表达可上调血小板P2Y12表达从而增强血小板活化，并上调P2Y12下游血小板聚集信号分子如PI3K-AKT[12]。由此推测，CFTR可能是一个新的、潜在的干预PCOS患者血小板功能及其介导的炎症因子生成的靶点，有利于发现降低PCOS患者发生血栓事件风险的途径。因此，本研究利用PCOS患者血样、体外细胞模型、基因干预CFTR等手段，探讨CFTR调控PCOS血小板活化的机制，为预防和治疗PCOS血栓相关并发症提供新靶点。

1、材料与方法

1.1实验对象

选取2021年4月至2021年10月在中山大学孙逸仙纪念医院妇科门诊就诊的PCOS患者，首次入院按鹿特丹诊断标准初次诊断为PCOS。对照组为同期行健康体检，按鹿特丹诊断标准排除PCOS。排除标准：未曾服用过任何雌孕激素类药物；入院前至少14d未服用任何抗血小板药物；排除癌症、炎症性疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、止血障碍和使用免疫抑制剂治疗的患者。受试者签署知情同意书，抽取肘前静脉血4～10mL,与枸橼酸钠抗凝剂混合(9∶1vol/vol)。本研究符合《赫尔辛基宣言》,并得到了中山大学伦理委员会(SYSKY-2023-555-01)批准。

1.2仪器与试剂

多功能酶标仪(美国Bio Tek公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf Centrifuge公司);电泳和电转装置(美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统(美国ChemiDocXRS公司);流式细胞仪(CytoFLEX)(美国Beckman Coulter公司);实时荧光定量PCR系统(CFX96 touch)(美国Bio-Rad公司)。人巨核细胞株(Megakaryocyte cell strains; Meg-01)细胞购自美国American type culture collection(ATCC),RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，CFTR抗体购自美国Novus公司，P2Y12抗体购自英国Abcam公司，P-selectin流式抗体购自BD公司。

1.3实验方法

1.3.1人洗涤血小板制备

取肘前静脉血4～10mL,与枸橼酸钠抗凝剂混合(9∶1vol/vol)抗凝，常温400g离心10min,分离富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP),900g离心10min,分离血小板，重悬在含apyrase 0.02U/mL的Tyrode's buffer(TB)溶液中。使用前TB 37℃溶解，加至含0.02U/mL的apyrase中，血小板终浓度调整至2.5×108platelets/mL,即得到洗涤的血小板(washed platelets, WP)。

1.3.2 MEG-01细胞培养

MEG-01细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，培养条件37℃、5% CO2。每隔2～3d换液，取对数生长期生长状态良好的细胞用于实验。MEG-01细胞密度达到60%～70%时，用不同浓度胰岛素及硫酸脱氢表雄酮(DHEA)刺激MEG-01细胞，以模拟PCOS患者体内高雄激素及高胰岛素血症环境，构建体外PCOS模型，分别培养24、48、72h后提取血小板。

1.3.3生物影像系统MQAE荧光测定ESCs胞内Cl-浓度瞬时变化

将处理好的单细胞种于细胞爬片，待细胞稳固贴在细胞爬片，使用NKH缓冲液冲洗盖玻片，除去多余的培养基及细胞代谢产物。将含细胞的细胞爬片沥干水分，置于湿盒，滴加100μL的MQAE工作液(含5mmol/L MQAE的NKH缓冲液),37℃避光孵育30min。孵育完成，使用NKH缓冲液冲洗细胞爬片3次，除去多余的染料。随后置入细胞记录槽，加1mL的NKH缓冲液，盖上盖玻片，转移至倒置显微镜系统，并接入灌流装置，以1mL/min速度灌流NKH缓冲液。使用4900滤光模块记录细胞MQAE的荧光强度。MQAE的荧光强度和[Cl-]i呈反比关系，即MQAE荧光强度越强，则代表[Cl-]i越低。为测定[Cl-]i绝对值，需进行[Cl-]i标准曲线的制作。实验时，首先灌流NKH缓冲液并记录MQAE的初始荧光强度F0,随后依次灌流含不同浓度Cl-的HEPES缓冲液。并记录不同浓度时，达到平台期的MQAE荧光强度Ft(t=0,30,70,100)。荧光信号采集结束后，根据公式变换得到方程：F0/F=1+Ksv[Cl-]。以F0/Ft为纵坐标，t对应的[Cl-]为横坐标，通过拟合得到校准的回归方程式Y=aX+b。其中斜率a即为MQAE在该细胞中的Ksv值。最后带入F/F0,即可求出[Cl-]0,此时为静息状态下的[Cl-]i。全细胞斑片钳记录Cl-电流实验：将预先处理好的细胞种在细胞爬片，待细胞贴片，将细胞爬片置于灌流槽，细胞外液以恒定速度缓慢灌流。玻璃微电极由硼硅酸毛细玻璃管经电极拉制仪拉制而成，根据细胞大小选择不同的程序，将玻璃微电极拉制成不同的口径。将细胞内液灌入玻璃微电极中，轻弹以除去玻璃微电极里的气泡。待玻璃微电极进入细胞外液后，观察入液电阻以10～20MΩ为宜。显微镜下将细胞移动至视野中央，使用V-Clamp模式，使用电子微操系统移动玻璃微电极，使得玻璃微电极的尖端轻碰到细胞膜表面，此时电阻迅速增大至约100MΩ,停止移动玻璃微电极，轻轻抽吸负压以形成稳定的负压，待封接电阻为1GΩ以上，并稳定1～3min,即认为高阻封接成功。此时脉冲消失，补偿电极电容。进一步抽吸负压或使用电击将细胞破膜。当出现明显的充电放电峰后，即认为破膜成功。此时形成全细胞记录模式。然后对串联电阻进行补偿，根据所限定的程序进行电流的记录开始记录细胞电信号。细胞钳制点位为-40mV,步阶电压梯度为20mV。从-100mV至100mV,持续时间100ms。采集数据和分析数据均使用pClamp10.0软件。细胞电流大小以电流密度pA/pF的形式表示。以上所有实验步骤均在室温且接地的情况下完成。

1.3.4免疫印迹法

将细胞或血小板加RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂冰上裂解20min。4℃、15 000×g离心15min,得到蛋白上清。SDS-PAGE电泳2h,转膜。封闭90min,与一抗4℃孵育过夜，洗膜，用二抗孵育90min, ECL反应显色，显影。使用Image J 1.42软件，对目的蛋白表达进行相对定量分析。比较PCOS患者与正常对照组CFTR、P2Y12、SGK1、pSGK1水平差异。

1.3.5实时定量PCR实验

用Trizol试剂(Invitrogen)从血小板和巨核细胞中提取总RNA,用Roche的Transcriptor cDNA Synthesis Kit逆转录RNA。以GAPDH mRNA为内参，2-ΔΔCt法测定各基因mRNA表达的倍数变化。见表1。

表1 RT-qPCR检测的引物序列

1.3.6流式细胞术测定血小板P-selectin表达

按前述方法制备好血小板，1%多聚甲醛固定15min, 500g离心5min,用TB洗涤两次，洗涤结束后再用TB重悬，调整血小板浓度至1×106platelets/mL。加FITC anti-human CD62P抗体，浓度为2.5∶100,避光孵育30min, TB洗涤，上流式细胞仪检测。

1.3.7 CFTR过表达腺病毒转染

待转染细胞以细胞密度约为70%～80%接种于培养皿，加CFTR过表达腺病毒，使得病毒的MOI值为200MOI。继续培养48h后用于后续实验。

1.3.8 SGK1 siRNA干扰链转染

待MEG-01细胞长至70%～80%时进行转染，取SGK1 siRNA干扰链(50nmol/L)于125μL不含血清基础培养基的EP管，室温孵育5min;取3.75μL转染试剂Lipofectamine3000 Reagent加至另一含125μL基础培养基的EP管，室温孵育5min;将上述两种混合物混合，轻轻吹打混匀，室温孵育5～10min。弃6孔板中细胞培养基，用PBS轻柔洗细胞2次，每孔加500μL无血清的基础培养基。将上述孵育好的混合物加至6孔板，充分混匀，置细胞培养箱培养，48h后进行后续实验。

1.3.9生殖内分泌激素与血生化指标测定

采集受试者月经周期第2～5d空腹(禁食至少12h)肘静脉血并分离血清冻存备用。采用化学发光法测定催乳素(Prolactin, PRL)、雌二醇(Estradiol, E2)、孕酮(Progesterone, P)、雄激素(Testosterone, T)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)含量(ACS180 SE,拜耳，德国)。采用血细胞分析仪进行血小板计数(Sysmex XN9000,日本)。采用全自动生化分析仪测定血糖水平(AU5821;Beckman Coulter,美国)。采用化学发光免疫分析法测定胰岛素水平(ADVIA Centaur XP;西门子，北京中国)。患者胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)程度用稳态模型胰岛素抵抗评价指数(homeostasis model assessment of IR,HOMA-IR)进行评估。HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5。

1.4统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件。数据采用表示，两组间采用成组设计t检测，三组或三组以上采用one-way ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1患者的一般情况、血糖、胰岛素及性激素情况

PCOS和对照组的月经周期、LH、PRL、T以及0、1、2h胰岛素和血糖及HOMA-IR比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2实验组与对照组CFTR表达及血小板活化情况

PCOS患者血小板上CFTR蛋白表达显著下降(图1A)。筛查其它几个分子基础明确的Cl-通道的蛋白表达，发现血小板上有TMEM16A Ca2+激活Cl-通道和LRRC8A容积调控性Cl-通道蛋白表达，但对照组和PCOS组间无显著差异(图1B、C)。PCOS患者的血小板活化指标P-selectin表达显著高于对照组(图1D),且与CFTR表达呈负相关(图1E),同时发现CFTR表达与HOMA-IR(图1F)、睾酮水平(图1G)呈负相关。与对照组相比，PCOS患者血小板炎症因子CCL5、IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高(图1H)。

2.3实验组与对照组血小板的胞内氯浓度、SGK1、pSGK1表达

MQAE法检测血小板内氯离子浓度，发现PCOS组血小板胞内氯浓度显著高于Control组(图2A),同时SGK1的磷酸化(Ser422)增加(图2B)。

表1患者基线资料对比

图1 CFTR与PCOS血小板活化及炎症相关

2.4实验组和对照组血小板炎症相关指标变化

使用MEG-01巨核细胞系，创建PCOS模型，发现高雄激素及胰岛素抵抗可导致血小板活化、CFTR表达下降、[Cl-]i升高、SGK1磷酸化(Ser422)增强，CFTR过表达可显著抑制血小板活化，同时降低了血小板的[Cl-]i及SGK1的磷酸化(图3)。

2.5 SGK1影响血小板炎症及活化

在MEG-01细胞中转染入SGK1干扰链，发现血小板炎症因子显著降低，抑制了血小板活化(图4)。提示SGK1通过调控血小板炎症，进而参与CFTR Cl-通道调控的血小板活化过程。

图2 PCOS患者血小板胞内氯浓度及SGK1磷酸化升高

图3 CFTR通过影响胞内氯浓度调控SGK1磷酸化及血小板活化

图4 SGK1影响血小板炎症及活化

3、讨 论

PCOS患者血栓形成的风险较正常人升高，同时慢性低度炎症已被证实是PCOS的发病核心之一[13]。本研究发现，与对照组相比，PCOS患者的血小板活化指标P-selectin显著升高，血小板炎症因子CCL5、IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高，提示PCOS患者血小板炎症亢进引起血小板活化，进而形成血栓。

3.1激发PCOS患者血小板炎症及活化的具体机制

本课题组前期研究发现，CFTR氯通道可调控血小板P2Y12表达从而影响血小板活化。本研究进一步发现，PCOS患者的血清胰岛素水平及雄激素水平明显高于对照组，同时CFTR蛋白表达较非PCOS患者降低；对照组和PCOS组的血小板上筛查了其它几个分子基础明确的Cl-通道的蛋白表达，发现血小板上虽有TMEM16A Ca2+激活Cl-通道和LRRC8A容积调控性Cl-通道蛋白表达，但两组间无显著差异。PCOS患者血小板活化及血小板介导的炎症因子的增加可能受CFTR氯离子调控。

已发现SGK1对跨膜Cl-浓度改变可快速响应，进而启动下游信号通路并影响细胞增殖、细胞分化及炎症反应[14]。本实验发现，PCOS患者血小板的[Cl-]i升高，SGK1磷酸化水平升高；而CFTR过表达可引起血小板氯外流增加，胞内氯浓度因此降低，从而抑制SGK1激活和血小板活化。同时，细胞实验发现高雄和胰岛素抵抗可导致巨噬细胞/血小板的CFTR表达降低、[Cl-]i升高，从而促进SGK1发生磷酸化及血小板炎症因子升高。提示血小板中CFTR表达下降，引起SGK1磷酸化增加，最终引起血小板的活化，而PCOS患者血小板CFTR表达下降最可能的原因是高雄和胰岛素抵抗。

3.2 SGK1诱导血小板活化的途径

血小板表面的ADP受体主要为P2Y1和P2Y12;其中，P2Y1受体通过上调细胞内Ca2+诱导血小板形状改变，促进血小板活化。P2Y12受体可放大血小板活化反应，并通过抑制腺苷酸环化酶的活性放大和稳定聚集物，从而促进GPⅡb /Ⅲa活化；同时，P2Y12受体激活还可促进凝血酶的产生，激活凝血系统，稳定血小板-纤维蛋白血凝块[12]。在动物实验中也发现，P2Y12基因敲除小鼠的活化血小板和血小板白细胞聚集体显著下调[15]。本研究在MEG-01细胞中转染入SGK1干扰链，发现血小板炎症因子P2Y12显著降低，抑制了血小板活化。进一步提示了SGK1磷酸化增加，引起血小板炎症因子P2Y12的升高，最终导致血小板活化增加，血栓风险增加。但是，通过哪些分子信号通路介导，目前还不清楚。

综上所述，PCOS患者的血栓发生风险增加，其可能原因是高雄及胰岛素抵抗导致PCOS患者血小板中CFTR蛋白表达下降，从而导致血小板的[Cl-]i升高，SGK1磷酸化水平升高，引起血小板炎症因子P2Y12的升高，最终导致血小板活化增加，血栓风险增加。

参考文献:

[11]胡诗宛,杨佳.血小板活化与动脉硬化相关性的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2022,20(12):2205-2209

[12]李俊,杨涵滟,王冠蕾,等.Cftr通过调控二磷酸腺苷受体p2y_(12)影响血小板活化[J].中山大学学报(医学科学版),2021,42(4):521-527

基金资助:广东省自然科学基金面上项目(No:2024A1515013191);广东省医学科研基金(No:A2023339);

文章来源:陈冬梅,钟晓珠,梁伟莹,等.CFTR氯通道调控多囊卵巢综合征患者血小板活化及炎症的机制研究[J].现代妇产科进展,2024,33(11):838-842+846.