目前我国儿童青少年近视发病时间节点前移，发病时间提前到6-8岁[1],近视发病年龄与发展速度呈负相关。据世界卫生组织研究报告显示，我国青少年近视率高居世界第一，2020年儿童青少年近视率高达52.7%[2]。因此，我国近视防控工程具有急迫性与紧切性。

祖国医学通过中医药特色疗法，在疾病预防、亚健康康复、体质调理以及重建生理稳态等方面显示出良好效果，特别是“未病先防，既病防变”的思想非常符合现代近视防控理念。近年来，越来越多的中医疗法应用于青少年近视的临床治疗，部分取得了不错的疗效，中医药在近视防控中发挥了不可替代的作用[3,4]。近代著名中医眼科学家陈达夫[5]先生认为肝肾功能不足会促进近视的发生发展，睫状体归足厥阴肝经，若肝气不畅，气机受阻，则会影响睫状肌功能从而诱发近视。基于此，根据儿童青少年近视“脾肾不足，肝失条达，目筋不利”的初步理论，成都中医大银海眼科医院中医名家段俊国教授积累临床经验，选取具有健脾益肾调肝且药食同源的道地药材组成防控近视的经验方-养眼方，旨在探索健脾补肾内调法对儿童青少年近视的防控作用，临床中取得了较好疗效。

本研究通过建立透镜诱导型近视(lens-induced myopia, LIM)豚鼠模型，探究养眼方对实验性近视豚鼠眼部结构的影响。

1、实验材料与设备

1.1实验动物

选用3周龄英国三色短毛豚鼠30只，体质量180-220 g,购自重庆璧山腾鑫养殖场[SCXK(渝)2017-0010]。实验动物入组前均排除白内障、 角膜病变、近视等眼病，实验期间所有豚鼠自由摄食、进水，并给予富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素C。实验中严格遵守视觉与眼科动物研究协会(The Statement of Animals Research in Vision and Ophthalmic, ARVO)原则，并通过成都中医药大学动物伦理委员会审批(2021-25)。

1.2试剂

复方托吡卡胺滴眼液(批号：J20180051,参天制药中国有限公司);4 g/L盐酸奥布卡因滴眼液(批号：B2055,参天制药中国有限公司);10%戊巴比妥钠液(批号：20211109,国药集团股份有限公司);10%中性甲醛固定液[批号：20200507,福晨(天津)化学试剂有限公司];苏木素染液(批号：CR2102133,武汉塞维尔生物科技有限公司);伊红染液(批号：CR2101094,武汉塞维尔生物科技有限公司);养眼方主要药物有山药、枸杞子等，由四川新绿色药业科技发展有限公司提供。

1.3仪器

YZ24带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司);266型验光镜片箱(丹阳市华辉光学仪器有限公司);SW-1000眼科A型超声测量仪(天津市索维电子技术有限公司);徕卡-2016转轮式切片机(德国徕卡);JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司);BMJ-A型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂);RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司);PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司);Pannoramic 250数字切片扫描仪[3DHISTECH(Hungary)];JEM-1400FLASH透射电子显微镜(日本电子)等。

2、实验方法

2.1分组与造模

30只豚鼠随机分为空白对照组、近视造模组、养眼方干预组，每组10只。空白对照组不做任何处理，剩余两组使用-8.00 D的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate, PMMA)透镜与乳胶无毒气球制成的头套戴于豚鼠头部，调整好双眼位置。镜片下不压迫眼球，豚鼠能自然活动眼球，诱导右眼发生实验性近视，左眼位置圆形小洞充分暴露左眼，不影响各象限视野视物。每日清洁镜片及头套内部，早晚巡察2次。若发现脱落头套或镜片光学区域有划痕时，立即更换并佩戴[6]。

2.2干预方法

养眼方干预组每日灌胃养眼方混悬液(2 mL/200 g),药物浓度(0.126 g/mL);空白对照组和近视模型组灌胃等体积的生理盐水(2 mL/200 g)。连续干预4周。

2.3屈光度及眼轴长度测量

干预前及干预2周、4周时间分别对所有豚鼠右眼屈光度及眼轴数据进行测量，双眼点复方托吡卡胺滴眼液3次/5 min,等待20 min瞳孔充分散开后进行屈光度测量：在半暗室环境下将散瞳后的豚鼠右眼由专业验光师进行检影验光，检影距离为67 cm,每眼测量3次求平均值，屈光度梯度为0.25 D,屈光度结果以垂直及水平子午线的平均值记录。采用眼科A超测量豚鼠右眼眼轴长度，调整仪器参数适应于豚鼠活体测量，正式测量前3 min双眼滴用表麻药(4 g/L盐酸奥布卡因眼液),测量时始终保持探头与角膜顶点垂直，分别记录双眼5次数据获得平均值，测量后双眼予以左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染。测量过程均采用单盲法，所有测量由同两位操作熟练专业人员完成。

2.4光学显微镜

干预4周后，腹膜内注射1-2 mL/g的10%戊巴比妥钠液麻醉处死豚鼠后摘除右眼球，迅速置于10%中性甲醛固定液中。以上标本均按病理检验SOP程序进行，固定组织经全自动脱水机脱水，石蜡机包埋后，巩膜沿纵轴连续切片(切片的厚度为4μm)。并用苏木精-伊红染色，最后封片。采用Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，观察视网膜及巩膜的组织学和形态学。

2.5透射电镜

待豚鼠如2.4方法麻醉后，迅速进行组织分离摘除右眼球，1 min内放入3%戊二醛溶液中，使组织细胞尽量保持原有状态，新鲜样本固定后、冻存、1%四氧化锇再固定、丙酮逐级脱水、Ep812包埋，制成60-90 nm的超薄切片，后用醋酸铀和枸橼酸铅染色。最后采用日本电子生产JEM-1400FLASH透射电镜对铜网进行图像采集，每张铜网先于6 000倍下观察，选择要观察的区域采集图片，观察具体病变。

2.6数据统计分析

采用SPSS 26.00统计学软件进行数据处理分析，进行正态分布及方差齐性检测，计量资料均采用均数±标准差(x¯±s)表示，同一组豚鼠干预前后眼轴长度及屈光度的组内差异比较采用配对样本t检验，两组组间比较为独立样本t检验，多组间比较干预前后数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA检验),检验水准α<0.05。

3、实验结果

3.1屈光度和眼轴长度

使用-8.00 D凹透镜诱导豚鼠右眼的近视发育，屈光度结果见表1,干预前各组豚鼠均为远视，组间无差异(P>0.05);干预4周后，与空白组对照组对比，近视造模组与养眼方干预组的近视性屈光度均增加(P<0.01)。眼轴结果见表2,干预前各组豚鼠眼轴组间无差异(P>0.05);干预4周后，3组豚鼠眼轴长度均增加(P<0.01),且近视造模组的近视性屈光度与眼轴长度较养眼方干预组增长更高(P<0.01)。

表1各组豚鼠右眼屈光度x¯±s,D

表2各组豚鼠右眼轴长度x¯±s,mm

3.2光学显微镜下观察视网膜及巩膜形态

图1显示3组豚鼠眼底结构，可见空白对照组的视网膜及巩膜结构清晰，厚度正常，视网膜神经节细胞层分布均匀、核仁清晰整齐；巩膜成纤维细胞呈蓝紫色，胶原纤维排列整齐、紧密，分布规则。近视造模组的视网膜神经节细胞层及内外核层全部减少，且排列无序；巩膜层明显变薄、巩膜胶原纤维排列紊乱且松散，纤维间空间增加。养眼方干预组视网膜层仅显示神经节细胞减少，余结构清晰；其巩膜厚度略有变薄，但纤维排列紧密且形态无明显异常。

3.3投射电镜观察观察视网膜及巩膜的超微结构

图2显示在电子显微镜下，空白对照组、养眼方干预组视网膜的膜盘结构完整，排列相对整齐；视野范围内视网膜的色素颗粒较多且排列相对整齐。近视造模组内段与脉络膜接触部分膜盘排列相对紊乱，色素颗粒排列紊乱且稀疏。

图3显示的巩膜组织由成纤维细胞和平行于眼球壁的胶原束组成，胶原纤维构成巩膜组织的框架[7]。观察胶原纤维的横截面直径：空白对照组的巩膜纤维排列整齐、粗细均匀；近视造模组出现巩膜纤维溶解、密度明显降低；养眼方干预组的巩膜纤维直径不均匀，但排列致密、无纤维溶解。

4、讨论

豚鼠的屈光状态、正视化机制与人类相似[7],常用于制作近视模型[8,9] ,并且豚鼠透镜诱导型模型(LIM)已广泛应用于近视的实验研究中[10,11,12,13]。本研究通过给3周龄豚鼠使用-8.00 D凹透镜诱导制成LIM模型，干预4周后与空白对照组相比，近视造模组与养眼方干预组右眼的近视性屈光度和眼轴均增加，且差异有统计学意义(P<0.01)。近视造模组右眼屈光度达到(-4.57±0.85) D、眼轴长度达到(7.88±0.07) mm;养眼方组豚鼠右眼近视性屈光度及眼轴增长明显低于近视造模组，组间差异有统计学意义(P<0.01)。实验结束后对豚鼠右眼的视网膜及巩膜的形态学观察发现，近视造模组豚鼠巩膜明显变薄、巩膜成纤维细胞出现溶解，视网膜神经节细胞及膜盘排列紊乱，这与刘素江[14]、Zi[7]等研究的豚鼠lens-induction(LI)眼和form-deprivation(FD)眼底的病理变化有高度一致性；养眼方组的巩膜厚度略薄，但细胞间排列致密、无溶解。由此可证实养眼方可有效延缓豚鼠近视的发展、改善近视眼底视网膜及巩膜的形态结构。

现代医学研究表明，眼睛的生长依赖于视网膜对活跃的视觉信号做出成像反馈，缺乏足够的细节图像曝光会导致屈光不正。Zhou X[15]团队研究发现来自视网膜的近视刺激会通过脉络膜，导致脉络膜厚度和血流量减少，从而促进视网膜、视网膜色素上皮和脉络膜释放到巩膜的生物活性分子，加速巩膜重塑，并最终促进近视的发展[16];并且脉络膜血流是影响邻近巩膜组织氧合的主要因素。Nickla[17]也认为脉络膜血流量降低与巩膜缺氧有关，Wu[18]更明确地发现在两种不同近视模型中豚鼠的FD眼和LI眼的巩膜中，伴随组织缺氧标志物缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha, HIF-1α)的表达上调，表明巩膜缺氧是近视的共同特征。由此说明近视的发生发展与视网膜、脉络膜及巩膜的生理特性密不可分。

图1 HE染色后光学显微镜观察各组豚鼠右眼底结构(×100)  

图2透射电镜观察各组豚鼠右眼视网膜膜盘的超微结构(×5 000)  

图3透射电镜观察各组豚鼠巩膜纤维横截面的超微结构(×60 000) 

基于对近视发病机制的认识，中西医应用多种手段防控近视均被证实取得了不错的疗效，西医干预包括离焦设计的镜片[19,20]、角膜塑形镜[21,22]、低浓度阿托品滴眼液[23]等方式，通过改善视网膜远视离焦或缓解眼底缺血缺氧等途径，从而发挥控制近视进展的作用。但角膜塑形镜存在年龄、屈光度数限制及佩戴不当造成感染的风险[24,25];低浓度阿托品有畏光等不良反应，其长期使用的安全性仍存在争议[26]。祖国医学通过中医药特色疗法，包括穴位按摩、针灸、耳穴贴压、中药内服等多种疗法开展中医适宜技术近视防控手段[27,28],可有效预防近视的发生和进展、并防止高度近视等近视严重并发症的发生。其中中药内服方以益精通络方[6,29]、结膜Ⅳ号方[30]、驻景丸加减方[31,32,33,34]等为代表方剂，相关实验研究证实可有效抑制DIM、FDM豚鼠或小鼠的近视进展，改善近视眼底视网膜、脉络膜或巩膜结构，具有保护实验性近视动物的视功能及眼底微循环等作用。由此，推测本实验使用的“养眼方”可能对实验性近视有延缓作用。

传统中药煎煮存在口感不佳等局限，对于儿童青少年而言依从性欠佳，影响了其在临床中的广泛推进与应用。为减轻儿童对传统中药制剂的抵触心理，中医眼科名专家段俊国教授根据多年临床经验和“药食同源”的新思路提出食疗法-养眼方，方中含有枸杞、山药等药食两用食材及护眼元素。该方基于儿童青少年近视的中医病机“脾肾不足，肝失条达，目筋不利”,通过补肾明目、健脾益气、调肝疏经，运用中药内调法改善脏腑功能及经络气血循环，以期达到预防儿童近视发生发展的目的。其中，枸杞具有滋补肝肾、益精明目的功效，山药具有健脾、补肺、固肾、益精等多种功效，在治疗近视的方剂中多有出现，如明目地黄丸、石斛夜光丸、十子明目丸等。现代医学研究发现，枸杞[35]的关键活性成分-枸杞多糖(LBPs)具有抗炎、抗氧化等作用[36,37],且可抑制HIF-1α的表达[38],其信号通路与近视密切相关。山药块茎营养丰富，含有抗性淀粉、甾体皂苷元素、贮藏蛋白薯蓣皂苷元、黏液多糖等多种生物活性代谢产物，这些物质有助于提高免疫力，扩张血管，促进血氧流动，以显示出山药作为功能食品的巨大潜力[39]。养眼方中的食物还含有眼内重要营养物质——α-亚麻酸(ALA),这是一种对人类大脑和视网膜发育有益的ω-3系列脂肪酸，其主要中间代谢物DHA和EPA[40,41]可有效改善视觉功能，促进大脑发育。温州医科大学研究组[42]最近对ω-3多不饱和脂肪酸膳食补充剂的研究也证实了ω-3可有效控制近视的进展和眼轴延长。

综上，养眼方具有健脾补肾、益精明目、改善微循环的功效；可有效延缓豚鼠近视的发展、改善近视眼底视网膜及巩膜的形态学结构。本研究为养眼方在近视防控的研究中提供初步理论依据，但其具体用于近视防控应用的剂量、剂型以及食品的生物利用度还有待未来进一步的机制研究和大样本临床研究探寻。

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基金资助:四川省科技计划项目(2017SZ0023);

文章来源:吴晓筱,聂莹莹,刘春等.养眼方对透镜诱导型豚鼠眼部结构的影响[J].成都中医药大学学报,2023,46(03):