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烯醇化酶3表达与结直肠癌临床病理特征及生存相关性分析

2024-11-30 39 上传者：管理员

摘要：目的探讨结直肠癌(CRC)中糖酵解相关烯醇化酶3(ENO3)表达与患者临床病理特征及预后生存的相关性。方法采用免疫组织化学染色技术检测了154例CRC患者FFPE组织样本中的ENO3蛋白表达，经免疫染色评分，进行临床病理资料统计关联分析和生存分析。结果结直肠癌组织中ENO3表达强弱与患者年龄、性别和肿瘤部位、大小、组织分级、病理分期、淋巴结转移，以及KRAS、NRAS和BRAF等基因的热点突变均无统计学相关性。但是，生存分析结果表明，ENO3蛋白低表达患者较ENO3高表达患者具有更长的总生存期(危险比为0.425,95%CI=0.197～0.752)。结论 ENO3在CRC中的生物学作用并非糖酵解途径促进CRC发生发展，而可能是治疗反应影响因素，这可能与ENO3蛋白的铁死亡抑制功能相关，但具体分子机制需进一步研究。

关键词：
发病率
烯醇化酶
糖酵解
结直肠癌
铁死亡
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结直肠癌(CRC)是最常见的恶性消化系统肿瘤之一，全球每年约有190万新发病例，93万死亡病例，在各类肿瘤中发病率居第三位，死亡率居第二位，且呈逐年上升趋势[1]。2020年中国数据显示，新诊断结直肠癌病例占全球新发病例的28.8%,死亡病例占全球相关死亡病例的30.6%,给我国社会带来巨大负担[2-3]。目前，结直肠癌的综合治疗，包括手术切除、新辅助放化疗、术后放化疗、靶向治疗和免疫治疗都已取得长足进步，显著改善了患者预后，提高了患者生存率[2-3]。目前，CRC患者的临床治疗和预后主要还是基于TNM分期系统[4],但是肿瘤生物学是一个复杂过程或状态，即便是同一阶段的个体也可能在预后和临床治疗的反应上表现出巨大异质性。例如均为右半结肠肿瘤且TNM分期相同的患者，在预后、治疗反应和生物学机制上均存差异[5]。因此，探索更佳有效、准确的关键分子标志物，对可靠的预测患者预后和监测治疗是非常重要的。

烯醇化酶家族(Enolases)是细胞糖酵解途径中重要成分，广泛存在于从细菌到哺乳动物生物体内，主要包括烯醇酶1(ENO1)、烯醇酶2(ENO2)、烯醇酶3(ENO3)和烯醇酶4 (ENO4)[6-7]。Kong K W[8]及Chen J Y[9]的研究结果表明，ENO3作为一种糖酵解酶，可将2-磷酸甘油酸催化为磷酸烯醇丙酮酸，其表达下调可显著抑制体外肿瘤细胞生长。已有研究报道ENO3对CRC具有预后诊断价值[10],及与结直肠癌发生进展相关[9],但其表达与CRC临床病理特征的关系尚不清楚。因此，在本研究中，我们共收集了154例CRC患者FFPE样本，通过免疫组织化学染色(IHC)技术，结合统计学关联性分析了ENO3表达与患者临床病理特征及生存预后关系。

1、材料与方法

1.1主要试剂和仪器

ENO3抗体(GeneTex, GTX113429);HRP辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥);人类KRAS、NRAS和BRAF基因突变检测(PCR-荧光探针法，武汉友芝友);组织切片机(Thermo);光学显微镜(奥林巴斯);LightCycler 480荧光定量PCR仪(Roche)。

1.2组织样本

本研究内容和流程均已获得徐州医科大学附属宿迁医院伦理委员会批准(伦理号：20210134B)。于本院组织病理样本库中共获取了154例2017年至2019年期间的CRC FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedded)标本。其中，研究所用FFPE样本、有关临床病理资料及随访信息(随访6个月/次)的获取和利用均按照伦理程序和规范进行。

1.3免疫组织化学染色(IHC)及染色评分

组织切片机上制备5μm组织切片，置于防脱载玻片上；室温二甲苯脱蜡3次，每次10min;用无水乙醇及95%、80%、70%乙醇和蒸馏水、PBS递次水化处理组织切片，于3%双氧水中10min灭活内源性过氧化物酶活性；置EDTA抗原修复液(pH 8.0)中高温高压2min,自然冷至室温；PBC洗涤后滴加抗ENO3抗体(GeneTex, GTX113429;稀释比1∶350)50μL/样本，4℃过夜；PBS冲洗3次，每次5min;滴加辣根过氧化物酶标记二抗50μL/样本，室温孵育30min; PBS洗涤后，滴加DAB显色剂室温孵育5min,自来水冲洗10min终止反应；经苏木精复染、稀盐酸分化后，经常规脱水、透明、中性树胶封片后，待检。

对胞浆表达的ENO3蛋白进行染色评分，标准为：无着色(0);弱的、不均匀棕黄着色为弱阳性表达(+);呈不均匀中等强度的棕黄着色的为中等强度阳性(++);≥10%细胞呈棕褐色着色的为强阳性表达(+++)。统计分析时，将0/+评分定义为ENO3蛋白低表达组，++/+++定义为ENO3蛋白高表达组。

1.4 KRAS、NRAS和BRAF基因突变检测

由病理医师阅片过程中，选取合适蜡块组织样本，制备蜡卷，进行DNA提取，测定DNA浓度及质量后，采用ARMS-PCR技术进行KRAS、NRAS和BRAF基因突变检测(武汉友芝友),于LightCycler 480荧光定量PCR平台(Roche)按照试剂说明进行ARMS-PCR反应及结果判定，同时设立阴性及阳性对照以保证结果的准确性。

1.5统计学分析

以中位数±标准差或n(%)表示相应数据。所有统计检验均使用SPSS 21.0软件包进行。连续数据采用Student’s-t检验，计数资料采用卡方检验。采用Kaplan-Meier方法进行生存估计，通过Log-rank检验比较两组间生存曲线差异。P<0.05认定为有统计学差异。

2、结果

2.1患者基本特征

154例CRC患者具体病理特征结果见表1。

表1纳入研究患者的临床病理特征

随访时间[中位数(范围),月]23.50(1.0-51)

2.2 ENO3蛋白表达分级及其与结直肠癌临床病理特征和预后生存之间的相关性分析

ENO3蛋白定位于胞浆，在154例FFPE标本中未观察到阴性染色样本，其中，ENO3低表达样本60例，高表达样本94例。所观测的各项人口学数据，如年龄分布、性别比例在ENO3蛋白高、低表达组之间无显著统计学差异(表2)。此外，ENO3蛋白表达与肿瘤发生部位、大小、组织学分级、病理分期、淋巴结转移情况，以及KRAS、NRAS和BRAF V600E等突变情况和基因组微卫星稳定状态无显著统计学关联(表2)。随访至24个月时，患者总生存分析发现，ENO3低表达组患者死亡事件发生频度13.3%(8/60),高表达组患者死亡事件发生频度28.7%(27/94);并随着随访时间的推移，其低表达组患者较高表达患者具有更长的总生存期，其危险比为0.425(95%CI=0.197～0.752,P=0.013)见图1。

表2 ENO3蛋白表达分级与结直肠癌临床病理特征之间的相关性比较

图1 ENO3蛋白高、低表达组患者的总生存曲线分析

3、讨论

烯醇化酶家族是细胞内糖酵解途径中的重要蛋白酶类，包括烯醇酶1(ENO1)、烯醇酶2(ENO2)、烯醇酶3(ENO3)和烯醇酶4(ENO4)。其中，ENO1表达与膀胱癌、胃癌和结直肠癌等多种肿瘤相关[11-12]。ENO4烯醇酶与精子发育和活性密切相关[13]。ENO2也称为神经元特异性烯醇化酶(NSE),是糖酵解酶烯醇化酶的细胞特异性同工酶，主要在成熟神经元和神经元来源的细胞表达[13],可以作为一种可靠的肿瘤标志物，区分早期恶性结直肠肿瘤和良性肿瘤[14]。其ENO2表达与多种肿瘤的发生、发展相关[13],在肿瘤细胞中的作用主要是加速胞内糖酵解过程，以支撑肿瘤细胞高代谢、高增殖率需求[15]。与其他恶性肿瘤相似，CRC细胞典型特征也是细胞信号调控和能量代谢异常。ENO2在CRC中过度表达[16],与CRC转移相关[17]。然而，烯醇化酶(ENO)基因家族中的ENO3与ENO2相比，目前有关ENO3在肿瘤中的功能作用研究报道较少。Kong K W[8]等人研究结果表明，下调ENO3基因表达可体外抑制肿瘤细胞生长。Pan X H[10]等人发现，CRC组织细胞中高水平表达ENO2和ENO3基因；TCGA数据分析结果表明，此类ENO基因的低表达与CRC预后正相关，可作为结肠癌患者的有效预后生物标志物。另外，Chen等[9]的研究证实，ENO3可通过增强细胞糖酵解促进CRC进展，在CRC中显著上调，其高表达与CRC患者预后不良和临床分期呈较高正相关。然而，有研究表明[18],ENO3作用会具有肿瘤差异，研究结果显示肝癌组织中ENO3蛋白表达水平低于其正常对照组织。与前述CRC相关性研究不同，我们的研究结果表明，ENO3表达与CRC临床病理特征(肿瘤部位、大小、组织分级、病理分期、淋巴结转移，以及KRAS、NRAS和BRAF等基因的热点突变)不存在显著统计学关联性，但与CRC患者总生存期显著负相关。这提示，ENO3在CRC中的生物学作用可能并非通过糖酵解途径促进CRC发生发展，而是与治疗反应有关，其具体分子机制尚不清楚，需要进一步研究予以证实。

但是，目前最新研究表明，ENO3除了在磷酸丙酮酸水合酶活性、磷酸丙酮酸水合酶复合物及糖酵解过程发挥作用以外，还可以在抑制肿瘤细胞铁死亡过程[19]。铁死亡是一种新近发现的铁依赖的调节性细胞死亡形式，其发生的核心在于活性氧(ROS)产生和羟基自由基(·OH)介导的脂质过氧化及细胞质膜损伤[20]。但这个过程受到抗氧化剂和膜修复系统抑制，而ENO3参与的糖酵解过程可能参与了这一过程[19]。既往结直肠疾病的相关研究发现[19-20],铁死亡通路被激活是非肿瘤性疾病中细胞死亡的重要机制，同时也能介导结直肠肿瘤细胞死亡。目前，结直肠癌具有多种临床治疗手段。现有研究证实，这些治疗手段，包括放疗、化疗和靶向治疗等，都可以促进脂质活性氧和质膜损伤累积，导致细胞铁死亡[21];如顺铂已经被证实可诱导结直肠癌细胞铁死亡，其与细胞铁死亡诱导剂具有显著协同作用[22]。Park S等人研究表明，对于KRAS突变型结直肠患者，可通过诱导肿瘤细胞发生ACSL4依赖性铁死亡，增加其临床治疗有效性[23]。因此，依本研究结果合理推测，ENO3可作为一个潜在功能的治疗反应蛋白，能够通过靶向抑制其表达或功能，增加CRC细胞药物诱导铁死亡敏感性，作为CRC患者的补充治疗方式。可见，进一步ENO3与铁死亡的机制探索，有望成为CRC治疗新方向。

参考文献:

[21]熊寰,朱亿豪,胡志乔,等.铁死亡在结直肠疾病中的研究进展[J].中华结直肠疾病电子杂志,2021,10(1):4

文章来源:孟凡来,梁晓东.烯醇化酶3表达与结直肠癌临床病理特征及生存相关性分析[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(06):519-522+530.