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HPV16型E6癌基因对结肠癌细胞PD-1/PD-L1表达影响及机制研究

2025-03-28 76 上传者：管理员

摘要：目的：探讨人乳头瘤病毒(HPV)16型E6癌基因的表达与结肠癌细胞程序性死亡受体1(PD-1)及程序性死亡配体1(PD-L1)表达之间的关系。方法：运用含HPV16 E6癌基因的质粒转染HT-29和SW480结肠癌细胞株，检测PD-1、PD-L1的表达状态，同时评估对磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响，并通过高通量测序检测差异表达基因。结果：转染HPV16 E6癌基因后，HT-29和SW480均显示PD-1、PD-L1表达显著降低。在SW480细胞中，PI3K/AKT和STAT3蛋白的表达显著降低，但在HT-29细胞中表达显著上调，并且AKT的磷酸化水平升高。mRNA高通量测序结果显示，HPV16 E6过表达后有12 843个共同表达基因，HT-29细胞中有2 167个差异表达基因，SW480细胞中有2 933个差异表达基因。结论：HPV16 E6可显著降低PD-1、PD-L1的表达水平，但对不同细胞中PI3K/AKT和STAT3信号通路的影响并不一致，可能存在其他调控通路途径。

关键词：
人乳头瘤病毒
磷脂酰肌醇-3-激酶
程序性死亡受体1
程序性死亡配体1
结直肠癌
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大量研究表明,人乳头瘤病毒( human papillomavirus,HPV)感染是器官恶性肿瘤的主要病因,与全球约5%的癌症发生发展密切相关[1-2]。在HPV感染中,HPV16是最常见的高危型,其癌基因E6与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和迁移密切相关[3-5]。最近的研究显示,结直肠癌( colorectal cancer,CRC)存在较高的HPV16感染率,两者间存在密切的相关性[6]。但关于HPV16病毒癌基因对人结肠癌细胞程序性死亡受体1( programmed death receptor-1,PD-1)及程序性死亡配体1 ( programmed celldeath-ligand 1,PD-L1)表达的影响及其机制鲜见报道。本研究利用包含HPV16 E6癌基因的质粒转染HT-29和SW480结肠癌细胞,同时检测PD-1 / PD-L1表达状态,并分析磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase / protein kinase B,PI3K/AKT),信号传导和转录激活因子3(signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)信号通路,进一步探讨HPV16 E6癌基因对结肠癌细胞PD-1 /PD-L1表达的影响。

1、材料和方法

1. 1实验材料及细胞系

人结肠癌细胞株SW480细胞(CL-0223B,普诺赛)、HT-29细胞(CL-0118,普诺赛),完全DMEM培养基(南京凯基), Lipofectamine 3000转染试剂盒( Invitrogen),BCA蛋白定量试剂盒(武汉伊莱瑞特),超纯RNA提取试剂盒(江苏康为世纪),qPCR专用逆转录试剂(江苏诺唯赞),定量PCR检测试剂盒(江苏诺唯赞),HPV16E6质粒(ZvastBio),HPV16 E6(Santa Cruz),β-Actin(北京全式金),GAPDH(北京全式金),PI3K(Abcam),P-PI3K ( Affinity),AKT ( Proteintech), P-AKT(Abcam),STAT3 ( Proteintech),P-STAT3 (Abcam),PD-1(Proteintech),PD-L1(Abcam),通用型二抗(武汉赛维尔)。

1. 2实验方法

1. 2. 1细胞培养与转染。

将SW480及HT-29置于DMEM完全培养基(含10% FBS,1%青霉素/链霉素)中,于5% CO2培养箱37℃进行培养。选择对数生长期的细胞,分为三组:(1)过表达组(overexpression,OE):使用Lipferon 3000将含HPV16 E6质粒转染至细胞;(2)阴性对照组(negative control,NC):加入等体积的不含E6癌基因的空白质粒;(3)空白组(control):仅加入等体积的培养液。

1. 2. 2 qPCR检测。

提取各组细胞中的总RNA,采用RNA超纯提取试剂提取mRNA,利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度(OD260/ OD280 ),通过RNA逆转录试剂合成cDNA,以cDNA为模板,在荧光定量PCR仪上进行检测,以 β-actin为内参。反应条件为预变性:95℃10min,变性:95℃10s,退火:58℃30s;延伸:72℃30s(40 cycles)。采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。算出各组样本中的HPV16E6、PI3K、AKT、STAT3、PD-L1的mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 qPCR所用引物

1. 2. 3 WB检测。

收集各组细胞,加入适量RIPA裂解液,充分裂解后收集裂解液,12 000r/ min高速离心10min取上清液,使用蛋白BCA定量检测试剂盒进行蛋白定量。SDS凝胶电泳分离蛋白,电湿法转膜;3%的脱脂牛奶封闭液封闭1h;分别加入一抗,4℃ 孵育过夜;再加入二抗室温孵育2h;加入ECL发光液,使用超高灵敏度化学发光成像系统进行显影。

1. 2. 4 mRNA高通量测序。

取OE组和NC组的HT-29和SW480细胞,进行转录组学测序,检测mRNA的差异表达。测序平台为Illumina HiseqTM。这部分工作由生工生物技术公司(上海,中国)完成。测序结果的分析流程见图1。

1. 3统计学方法

应用SPSS19软件进行统计分析。所有实验重复3次,定量结果采用均数 ± 标准差(x±s)表示。两组之间定量数值比较采用独立样本t检验,多组之间定量数值比较采用单因素方差分析,两两比较采用S-N-K法。检验水准 α= 0. 05,P < 0. 05表示差异有统计学意义。

2、结果

2. 1 HPV16 E6转染后过表达

HPV16 E6质粒转染后,WB和qPCR结果显示,与NC组及Control组相比,OE组中HPV16 E6的表达显著升高(见图2)。

图2 HPV16 E6在结肠癌细胞中过表达

2. 2 HPV16 E6过表达调节PI3K/ AKT和STAT3信号通路

WB结果显示,与NC组比较,OE组HT29细胞中PI3K、AKT和STAT3的表达显著上调,AKT磷酸化水平升高(见图3a)。在SW480细胞中,OE组中PI3K、AKT和STAT3的表达显著下调,但磷酸化水平没有明显变化(见图3b)。荧光定量PCR结果显示,OE组内PI3K、AKT和STAT3 mRNA水平发生了显著变化(见图3c)。

图3 PI3K/ AKT和STAT3的表达分析

2. 3 HPV16 E6过表达下调PD-1、PD-L1表达

与NC组相比,在两种细胞系OE组中PD-1和PD-L1的表达均显著降低(见图4a、图4b)。SW480细胞中OE组PD-L1 mRNA显著升高,而HT-29细胞无显著变化(见图4c、图4d)。这说明E6可能在一定程度上促进了PD-L1转录,但翻译过程明显受到了抑制。

2. 4 HPV16 E6过表达对基因转录的影响

收集OE组和NC组细胞进行mRNA测序。Venn图显示,在所有样本中有12 843个共同表达的基因(见图5a)。利用火山图来可视化差异表达的基因。在HT-29细胞中共检测到2 167个差异表达的基因,其中上调基因1 394个,下调基因773个(见图5b)。而在SW480细胞中,共发现2 933个基因存在差异表达,其中上调基因1 851个,下调基因1 082个(见图5c)。GO分析结果显示,HPV16 E6的过表达可能影响细胞进展、凋亡和免疫调控等生物学机制,差异表达的基因也可能影响转录因子调控、蛋白合成、酶活性和细胞内信号转导的调控(见图5d、图5e)。

图4 PD-1和PD-L1表达显著下调

图5基因转录分析

3、讨论

CRC是恶性肿瘤中最常见的癌症类型,也是癌症相关死亡率的第二大主要因素,其发生发展涉及多种因素,其中肠道微生物群是研究的热点之一。近年来,人们越来越关注HPV与CRC之间的关系。Meta分析显示CRC的HPV阳性率有统计学差异,主要类型为HPV16 / 18[7]。同时研究发现HPV感染组的CRC累积发生率明显高于未感染HPV的组。HPV的存在与CRC风险增加相关[8]。这些发现揭示了HPV与CRC的密切联系,但影响其发生发展的调控机制需要进一步的研究。

免疫反应调节及肿瘤微环境状态一直是癌症免疫治疗的一个重要发展方向,其中针对PD-1 / PD-L1通路的抑制剂已被证明对黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌的治疗是有效的,表现出了良好的临床前景。研究发现CRC患者癌组织PD-L1阳性率高于癌旁组织,同时血清PD-1明显升高,PD-1 / PD-L1的异常表达可能参与CRC发生发展[9-11]。同时研究发现HPV感染的CRC中免疫细胞浸润明显增加,包括T细胞、γδT细胞、细胞毒细胞和浆细胞样树突状细胞,且淋巴细胞的细胞毒性反应增强,并证实HPV感染促进肿瘤相关巨噬细胞的M1型极化,提高了局部肿瘤相关免疫反应,提高了生存率。这些研究均提示HPV感染及PD-1 / PD-L1在CRC肿瘤免疫微环境中的作用[12-13]。我们的研究发现HPV16E6可以抑制HT-29和SW480两种结肠癌细胞系PD-1 / PD-L1的表达,这同样预示HPV感染的CRC患者可能有着更强的肿瘤免疫反应。

PI3K/ AKT及STAT3信号通路是与细胞代谢、增殖与分化、炎症及免疫等相关的重要细胞内信号通路[14-16],与PD-1 / PD-L1的表达密切相关,可能成为肿瘤治疗的重要靶点[17-22]。我们的研究发现,HPV16 E6过表达后,PI3K/ AKT和STAT3通路受到干扰,但是在HT-29和SW480表现并不一致,且mRNA和蛋白的表达变化不一致,说明基因的转录和翻译均受到了影响。

HPV16 E6癌基因主要是通过E3连接酶E6AP相互作用,促进肿瘤抑制因子P53的降解,减弱P53的调控作用[23-24]。在肿瘤细胞中,P53基因的突变率非常高,并伴有功能的改变。多项研究表明,HPV16 E6有可能抑制结肠癌中P53的活性[25-26]。其他研究还发现E6可与多种细胞因子结合调控细胞的基因转录和染色质稳定性[27],HT-29和SW480均在P53基因的273位出现G-A突变,导致Arg-His替换;然而,SW480在309位也有一个C-T突变,导致Pro-Ser替换。HT-29是野生型K-ras基因,SW480是突变型K-ras基因,K-ras基因的突变可以直接激活PI3K/ AKT信号通路。同时在研究中发现HPV阳性的CRC组织中有39个差异表达基因上调,而17个差异表达基因下调[28]。本次研究检测出HT-29细胞中有2 167个差异表达基因,SW480细胞中有2 933个差异表达基因。因此,虽然我们的研究证实了HPV16 E6的过表达抑制了PD1、PDL1表达,但可能不完全是调控PI3K/ AKT和STAT3信号通路所致,而与多种途径共同影响了细胞内信号通路有关。

综上所述,本次研究证明HPV16 E6可以显著降低结直肠癌细胞PD-1、PD-L1的表达水平,但不同细胞PI3K/ AKT和STAT3信号通路的影响不一致,同时在两组细胞中存在多个差异表达基因。这些研究为HPV感染的结直肠癌的研究提供了基础,我们将进一步探讨HPV与结直肠癌发生发展的调控机制,为临床诊疗提供新思路。

参考文献:

[9]许涛,余阳,方军,等. CDX-2､PD-L1､Ki-67在大肠癌组织中的表达及与临床病理､预后的关系[ J].中国临床研究,2022,35(5):639-643,648.

[10]潘泓宇,陆航.免疫检查点PD-L1和VISTA分子在结肠癌中的表达及意义[J].中国肿瘤临床与康复,2021,28(2):157-159.

[11]金晶,吴水莲,郭可俊.结肠癌患者外周血CD4+､CD8+细胞PD-1表达水平及其临床意义[ J].浙江创伤外科,2024,29(1):7-9,13.[12] Zhou J,Liu Y,Z

文章来源:邓晓,邱莎莎,缪作华,等.HPV16型E6癌基因对结肠癌细胞PD-1/PD-L1表达的影响及其机制研究[J].医学理论与实践,2025,38(06):913-917+926.