结肠癌是常见的恶性肿瘤,在全球恶性肿瘤中发病率和死亡率均位居前列[1],也是我国目前常见的恶性肿瘤之一。近年来,随着外科手术的发展及化疗药物的研发,根治性手术联合化疗成为治疗结肠癌的主要治疗手段,但结肠癌在确诊时约20%的患者已经发生了远处转移,即使手术成功切除了原发病灶,已经发生的远处转移也会成为结肠癌复发的主要风险因素[2]。结肠癌晚期重要脏器转移是其主要的死亡原因,探索结肠癌细胞侵袭转移的机制,靶向阻断癌细胞转移途径,成为肿瘤研究的关键问题。

结肠癌的发展和预后不仅与肿瘤本身特性有关,还与肿瘤微环境有关[3]。研究发现[4],肿瘤微环境中存在着大量的巨噬细胞,这些巨噬细胞主要来源于人血液中的单核细胞,被肿瘤细胞分泌的生长因子和趋化因子募集到肿瘤组织中,在肿瘤的生长与转移方面发挥着重要作用,因此这种巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞。TAMs具有高度可塑性,其不同的表型对肿瘤发展起着不同作用。M1型TAMs通过高呈递抗原发挥杀伤肿瘤细胞的作用,M2型TAMs抑制抗原呈递,促进肿瘤发展。M2型TAMs浸润在肿瘤组织中的数量是影响肿瘤侵袭转移的重要因素,如何调节TAMs成为肿瘤研究的热点话题。另外,越来越多的证据表明炎症与肿瘤的发生具有相关性,炎症影响结肠癌的发生、发展及预后[5]。核因子-κB(NF-κB)是调控炎症反应的重要转录因子,通过激活NF-κB可以高效诱导炎症细胞因子、趋化因子、黏附因子和炎性酶等基因的表达,使炎性反应级联放大,起到促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、增加肿瘤转移的作用[6]。因此,探究M2型TAMs与NF-κB在结肠癌侵袭转移中是否具有相关性,成为本实验的研究目的。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验细胞

人结肠癌LoVo细胞株和人白血病THP-1细胞株均购于美国模式培养物研究所。

1.1.2实验试剂

RPMI-1640培养基购自Corning公司;β-巯基乙醇购自Sigma公司;佛波酯购自Solarbio公司;RecombinantHumanIL-4、IL-13购自Peprotech公司;PerCP/Cy5.5anti-humanCD163Antibody、PEanti-humanCD206Antibody购自Biolegend公司;IL-10、TGF-β1酶联免疫吸附测定试剂盒购自BOSTER公司;全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自Solarbio公司;抗体NF-κBPathwaySamplerKit、N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、TCF8/ZEB1、兔二抗、鼠二抗购自CST公司;β-actinMonoclonalAntibody购自Immunpway公司;山羊抗兔IgGH&L(DyLight®488)购自Abcam公司。

1.2实验分组与建立共培养体系

1.2.1细胞培养

LoVo细胞使用RPMI-1640完全培养基(10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素溶液),THP-1细胞使用RPMI-1640完全培养基(10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素溶液,0.05mmol/Lβ-巯基乙醇),在37℃5%CO2培养箱中培养,2～3d传代,取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2实验分组

实验分为4组,对照组即单层培养LoVo细胞不予干预,实验组分为A、B、C三组且分别给予不同浓度的巨噬细胞(即1×106/mL、5×105/mL、2.5×105/mL)与LoVo细胞建立共培养体系。

1.2.3诱导M2型巨噬细胞并建立共培养体系

不同浓度的THP-1细胞悬液均以1.5mL/孔置于0.4μm孔径的Transwell上室中培养,用150ng/mL佛波酯将THP-1细胞诱导成巨噬细胞;培养2d后细胞中加入终浓度为20ng/mL的IL-4、IL-13,诱导巨噬细胞向M2型方向分化。将LoVo细胞以1×106/mL,2.6mL/孔种入六孔板,待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,两种细胞非接触式共培养24h,以模拟肿瘤的炎性微环境[7]。

1.3检测指标和方法

1.3.1流式细胞术检测CD163、CD206在细胞中的表达

用移液器吸净Transwell小室内细胞培养液,用PBS缓冲液缓缓冲洗贴壁巨噬细胞1次,胰酶消化巨噬细胞,PBS缓冲液洗2次(4℃1500r/min离心3min),用PBS缓冲液将细胞浓度调整为5×106/mL,向EP管中加入100μL细胞悬液及相应流式抗体,轻轻混匀,4℃避光孵育30min,1mLPBS缓冲液洗2次,500μLPBS重悬细胞,过滤后上机,使用FlowJo7.6进行数据分析。

1.3.2划痕实验观察细胞迁移能力

用marker笔在六孔板背面画线,将LoVo细胞种入六孔板,置于5%CO2,37℃培养箱中培养24h。LoVo细胞培养24h后于倒置显微镜观察,LoVo细胞铺满孔底后,吸净六孔板的细胞培养液,用10μL的枪头在孔内划一条垂直横线的竖线,PBS缓冲液轻轻冲洗孔底2次,吸净细胞残渣,更换新鲜培养基,与Transwell上室建立共培养体系,培养0h、24h后于倒置显微镜下取样并拍照,用ImageJ计算划痕面积。

1.3.3酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液IL-10、TGF-β1浓度

共培养体系建立24h后,取细胞上清液500μL,1000r/min,离心5min去除沉淀。按ELISA试剂盒说明书操作步骤进行实验,用酶标仪分别测定细胞上清液IL-10、TGF-β1浓度。

1.3.4WesternBlot检测NF-κB通路蛋白及EMT相关蛋白表达情况

蛋白样品采用SDS-PAGE进行电泳(80V,120min),转膜(300mA,90min),转膜结束后脱脂奶粉封闭2h,滴加一抗(1∶1000)4℃孵育过夜;TBST冲洗3次,10min/次,滴加二抗(1∶2500)室温孵育2h,TBST冲洗3次,10min/次,曝光成像。用ImageJ分析条带灰度值。

1.3.5免疫荧光技术检测NF-κBp65及E-cadherin入核情况

Transwell小室共培养24h后,吸取LoVo细胞培养液,每孔加入4%多聚甲醛固定15min,0.1%TritonX-100室温通透7min,3%BSA室温封闭30min;弃去封闭液,滴加一抗(稀释比例1∶200),4℃冰箱孵育过夜;复温45min,弃去一抗,滴加DyLight488-羊抗兔IgG荧光二抗(稀释比例1∶200),室温避光孵育1h,加入细胞核染液DAPI孵育5min,PBS冲洗后蘸取抗荧光淬灭封片剂滴入孔板内,于荧光显微镜下避光观察,拍照。用ImageJ进行定量分析。

1.4统计学方法

实验数据用均数±标准差(x¯±s)表示,运用SPSS22.0软件进行统计分析。数据符合正态分布的采用单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐的结果用LSD检验方法进行组间的比较,方差不齐或不服从正态分布的用Dunnett'sT3检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1M2型TAMs诱导形态学比较

通过观察发现,THP-1细胞为单个生长的悬浮细胞,形态圆润饱满、大小均一、折光性较好;THP-1细胞经PMA刺激2d后,诱导分化为Mφ型贴壁生长的巨噬细胞,大部分细胞为圆形,个别细胞生出伪足;向Mφ型贴壁生长的巨噬细胞中加入IL-4和IL-13刺激3d,继而诱导分化出M2型巨噬细胞,形态多样,突起明显,大多数细胞生出伪足,具体形态见图1。

图1THP-1分化为M2型巨噬细胞后的形态学变化(×40)

2.2M2型TAMs细胞特异性分子CD163、CD206共表达情况

根据流式细胞术检测结果发现,THP-1、Mφ型TAMs、M2型TAMs的CD163、CD206的共表达水平分别为(10.56±6.21)%、(28.57±4.44)%、(83.40±4.87)%,诱导后的M2型TAMs其细胞特异性分子CD163、CD206的共表达水平远远高于THP-1细胞的表达水平,差异有显著统计学意义(P<0.01)。说明本实验所需M2型TAMs诱导成功(图2)。

图2CD163、CD206表达情况

2.3M2型TAMs对LoVo细胞迁移的影响

对照组、A组、B组、C组划痕实验愈合率分别为(27.076±0.016)%、(40.271±0.005)%、(34.655±0.012)%、(30.484±0.019)%。与对照组相比,A组、B组愈合显著,差异有显著统计学意义(P<0.01);C组愈合水平也明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示M2型TAMs可以明显促进LoVo细胞迁移能力(图3)。

2.4M2型TAMs对细胞上清液IL-10、TGF-β1含量的影响

实验结果显示,A组、B组IL-10、TGF-β1含量明显高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01);C组IL-10含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1含量高于对照组,差异无统计学意义。实验发现细胞上清液中IL-10、TGF-β1的含量与M2型TAMs浓度成正相关(表1)。

2.5M2型TAMs对结肠癌细胞NF-κB通路及EMT相关蛋白表达的影响

在NF-κB通路相关蛋白表达方面,A组、B组、C组与对照组比较,IKKα、IKKβ蛋白的表达量随M2型TAMs含量的降低而显著降低,IκBα蛋白的表达量随M2型TAMs含量的降低而显著升高,其中A组与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)(表2)。

在EMT相关蛋白表达方面,A组、B组、C组与对照组比较,E-cadherin蛋白的表达量随M2型TAMs含量的降低而显著升高,其中A组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。A组、B组、C组与对照组比较,N-cadherin、Vimentin及ZEB1蛋白的表达量随M2型TAMs含量的降低而降低,差异无统计学意义(表3,图4)。

图3细胞划痕愈合图(×40)

表1细胞上清液中IL-10、TGF-β1含量(x¯±s,pg/mL)

表2NF-κB通路相关蛋白表达水平(x¯±s)

注:与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。

表3EMT相关蛋白表达水平(x¯±s)

注:与对照组相比,*P<0.05。

Note:Comparedwiththecontrolgroup,*P<0.05.

图4各组LoVo细胞NF-κB通路及EMT相关蛋白表达

2.6M2型TAMs对LoVo细胞NF-κBp65及E-cadherin入核情况的影响

根据免疫荧光图像结果及LoVo细胞NF-κBp65、E-cadherin入核情况定量分析可知,对照组NF-κBp65核因子入核较少,核因子在细胞核和细胞浆中均有分布,A组、B组、C组随着M2型TAMs含量的升高,NF-κBp65入核明显,在细胞核中表达增多。对照组E-cadherin入核较多,核因子主要分布于细胞核中,A组、B组、C组随着M2型TAMs含量的升高,E-cadherin入核明显减少,在细胞核与细胞浆中均有表达(表4,图5-6)。

表4NF-κBp65、E-cadherin入核情况定量分析(x¯±s,%)

注:与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。

图5NF-κBp65入核情况(×100)

图6E-cadherin入核情况(×100)

3、讨论

TAMs在炎症相关肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[8]。本实验通过建立M2型TAMs与LoVo细胞共培养体系,模拟炎性微环境,探讨M2型TAMs促进肿瘤发展的作用机制。实验结果表明,M2型TAMs可能通过激活NF-κB通路发生上皮间质转化(EMT),实现促进结肠癌细胞侵袭转移的作用。

为验证M2型TAMs对结肠癌细胞侵袭转移的影响,首先通过划痕实验得知M2型TAMs可促进结肠癌细胞增殖和迁移,这与VinnakotaK等人[9]的实验结果类似。M2型TAMs分泌的TGF-β1是一种多功能细胞因子,在早期肿瘤生长中起抑制作用,但在恶性进展过程中起促进作用[10]。TGF-β1可以通过Smad2/Smad3通路诱导胃癌细胞活化并促进VEGF-C的分泌,也可以通过TGF-β1/Smad通路促进EMT发生[11,12]。IL-10是M2型TAMs的分泌因子,属于Th2型分泌免疫抑制的细胞因子,发挥体液免疫的作用。当外源性或内源性刺激打破促炎因子和抑炎因子之间平衡状态时,易发生Th1/Th2漂移。在多种恶性肿瘤疾病的发生发展中发现,患者的机体内均存在Th1/Th2平衡漂移,常常Th2细胞占优势状态,可能与肿瘤的免疫逃逸有关[13]。

越来越多的研究表明,慢性炎症与肿瘤关系密切,NF-κB是调控炎症反应的重要转录因子,NF-κB的激活可在长期慢性炎症刺激下诱导肿瘤的发生。RelA(p65)的C端含有一个转录激活结构域(transactivationdomain,TAD),可以通过募集转录共激活物和移除转录阻碍物而促进转录。肿瘤组织中NF-κBp65还与血管内皮生长因子(VEGF)表达密切相关,NF-κBp65蛋白活化后对VEGF具有正向调节作用,促使肿瘤血管和淋巴管新生,为肿瘤生长和转移提供营养和途径[14]。IκB蛋白是NF-κB的抑制蛋白,在抑制或终止NF-κB活性方面起到重要作用,IκBα蛋白可以结合静止细胞内NF-κB,使其滞留在细胞质内,也对细胞核内的NF-κB发挥作用,IκBα与NF-κB结合,促使NF-κB从DNA上解离下来,重新回到细胞质中[15]。IKKα、IKKβ是NF-κB的阳性调节因子,在调节NF-κB活性方面占主导地位,通过调节NF-κB促进肿瘤、炎症的发展。IKKβ是NF-κB重要的上游激酶,IKKβ可以引起IκBs的磷酸化,继而被泛素连接酶复合体识别发生泛素化,降解IκBs,从而使IκBs失去对NF-κB的抑制能力,释放的NF-κB进入细胞核,与DNA结合进而调控多种基因的表达[16]。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞失去细胞极性和细胞间黏附特征,形成具有迁移和侵袭能力的间质细胞的过程。E-cadherin是在上皮细胞中表达的钙依赖性跨膜糖蛋白之一,通过黏附连接维持上皮细胞间的横向联系,在维持细胞极性及其组织学结构中发挥着重要作用。有研究[17]指出转录因子ZEB1的表达受到NF-κB的调控,进而破坏细胞间的紧密连接,降低E-cadherin表达水平,提高间质蛋白N-cadherin和Vimentin表达水平,促进细胞迁移能力。本研究发现随着M2型TAMs含量的增加,具有促进肿瘤细胞增殖转移作用的细胞因子IL-10、TGF-β1的含量也明显增加。通过测定NF-κB通路IKKα、IKKβ、IκBα蛋白表达水平及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1表达水平,免疫荧光观察NF-κBp65和E-cadherin入核情况,明确M2型TAMs可以激活NF-κB通路,从而介导EMT的发生。

本研究提示在结肠癌侵袭转移的研究中,找到M2型TAMs与NF-κB通路之间的连接点,有效阻断M2型TAMs与NF-κB之间的联系,可能成为结肠癌治疗过程中又一突破点。

王方园,孔宪斌,杨玉莹,彭莹莹,卜志超,窦晓鑫,孟静岩.M2型TAMs激活NF-κB通路促进结肠癌细胞侵袭转移的实验研究[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3651-3656.

基金:国家自然科学基金项目(编号:81973728);天津市自然科学基金项目(编号:18JCZDJC36600).