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没食子酸辛酯通过调节唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白影响结肠癌细胞的生物学功能研究

2023-07-21 84 上传者：管理员

摘要：探讨唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白(CLPTM1L)基因对结肠癌细胞增殖和迁移的影响，以及没食子酸辛酯(OG)对CLPTM1L的调控作用。方法用免疫组织化学方法检测CLPTM1L蛋白在结肠癌中的表达水平。将HCT116细胞分为实验组(CLPTM1L基因过表达病毒感染处置)、对照组(过表达对照病毒感染处置)、空白组(给予含二甲基亚砜的培养基处理)和低、中、高剂量实验组(分别给予含5、10和15μmol•L-1 OG处理)。用细胞计数试剂盒-8实验法检测细胞的增殖能力，用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，用蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和CLPTM1L蛋白的表达水平。结果癌组织和癌旁组织中CLPTM1L高表达率分别为66.67%(58例/87例)和36.78%(32例/87例),差异有统计意义(P<0.05)。实验组和对照组的细胞增殖能力(第7天)分别为3.73±0.02和2.81±0.18,细胞迁移率分别为(47.75±2.76)%和(28.41±2.53)%,MMP-2蛋白相对表达水平分别为0.93±0.05和0.41±0.11,差异均有统计学意义(均P<0.05)。低、中、高剂量实验组和空白组的细胞迁移率分别为(17.62±5.48)%、(11.80±3.74)%、(3.77±3.91)%和(26.25±1.57)%,CLPTM1L蛋白相对表达水平分别为0.79±0.05、0.71±0.13、0.51±0.13和0.92±0.04;与空白组比较，低、中、高剂量实验组的细胞迁移率和CLPTM1L蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 CLPTM1L基因在结肠癌中高表达，可作为治疗结肠癌的相关靶点，OG可以靶向CLPTM1L治疗结肠癌。

关键词：
唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白
增殖
没食子酸辛酯
结肠癌
迁移
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我国结肠癌的发病率和死亡率都呈显著上升趋势[1],患者在治疗过程中容易发生转移，晚期患者预后较差。唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白(cleft lip and palate transmembrane 1 like, CLPTM1L)基因最初是在筛查顺铂耐药相关基因时发现的，其在顺铂耐药的卵巢癌细胞中表达上调[2]。NI等[3]研究发现，CLPTM1L高表达的肺癌患者比CLPTM1L低表达的患者生存期更差，肺癌细胞中敲除CLPTM1L的表达可以抑制细胞迁移和侵袭。没食子酸是一种广泛存在于漆树、五倍子、茶叶、葡萄籽及绿茶等天然植物中的多酚化合物，在抗炎、降低血糖血脂、抗病毒、抑菌、抗氧化及抗肿瘤等方面具有生物学作用[4]。没食子酸辛酯(octyl gallate, OG)是一种没食子酸衍生物。本研究通过体外实验研究OG靶向CLPTM1L基因对结肠癌HCT116细胞生物学功能的影响，旨在为结肠癌诊断和预后提供潜在检测和干预靶点。

一、材料与方法

1、材料

组织人结肠癌组织和癌旁组织组成的组织微阵列(HCol-Ade180CS-01),上海芯超生物科技有限公司提供，每个组织微阵列有174个样本，包括87例结肠癌组织和配对匹配的邻近组织。

细胞HCT116细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院。

药品与试剂内源性过氧化物酶阻断剂，规格：每瓶12 mL,批号：SA1022,购自博士德生物工程有限公司；OG,规格：每瓶25 mg,批号：S933801,购自美国Selleck公司。CLPTM1L抗体，购自美国SIGMA公司；基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，均购自美国CST公司。CLPTM1L基因过表达慢病毒，由上海吉凯基因合成。

仪器BioRad-680多功能酶标仪，美国Thermo-Fisher公司产品；双色红外荧光扫描成像系统，美国LI-COR公司产品；Pro 580ES光学显微镜，德国Zeiss公司产品；IS4000R全自动图像工作站，美国Kodak公司产品。

2、实验方法

2.1免疫组织化学实验[5]5]

实验前，65℃烤片30～60 min,脱蜡剂脱蜡，梯度乙醇水化。用柠檬酸盐修复液经微波炉高火抗原修复，自然冷却后，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)冲洗3次，每次5 min。内源性过氧化物阻断剂避光孵育20～30 min, PBS冲洗3次，每次5 min。干燥后，滴加一抗，4℃过夜。次日洗去一抗，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加酶标山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)聚合物室温孵育30～40 min, PBS冲洗3次，每次5 min。滴加DAB显影剂数秒至2 min,纯水冲洗。苏木素染液孵育10 s后，纯水清洗，中性树脂封片，自然晾干后拍照。

2.2细胞培养[6]6]

HCT116细胞复苏后，用含有1%青霉素/链霉素双抗溶液、10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于细胞培养箱中进行恒温培养(37℃,5%CO2)。

2.3细胞分组与处置方法

按病毒感染试剂说明书进行转染，分为实验组(CLPTM1L基因过表达病毒感染处置)和对照组(过表达对照病毒感染处置)。

将HCT116细胞分为空白组和低、中、高剂量实验组。空白组给予含二甲基亚砜的培养基处理；低、中、高剂量实验组分别给予含5、10和15μmol·L-1 OG的培养基处理。

2.4用蛋白质印迹法检测CLPTM1L和MMP-2蛋白的表达水平[7,8]7-8]

取等量蛋白样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA封闭液封闭2 h。将膜分别与一抗4℃孵育过夜，然后TBST洗涤3次，每次10 min,再加入HRP标记的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗，室温孵育2 h。用TBST洗膜3次，每次10 min,最后加入ECL发光液，于化学发光成像系统中曝光显影。

2.5用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)实验法检测细胞的增殖活性[9]9]

将“2.3”分组方法中实验组和对照组细胞以每孔1 700个接种于96孔培养板，每组设3个重复孔。培养1、3、5和7 d后，弃培养基，加入CCK-8溶液，继续孵育2 h。用酶联免疫检测仪在450 nm处测定各孔的光密度(optical density, OD)值。

取对数生长期的HCT116细胞，以每孔1×104个细胞密度接种到96孔板中培养24 h,每组设6个重复孔，加入0、5、10、20和30μmol·L-1 OG,继续孵育24 h后，加入CCK-8溶液，继续培养2 h,其余步骤同上。

将实验组和对照组细胞以每孔1×104个接种于96孔培养板中培养24 h,每组设3个重复孔，加入5、10和15μmol·L-1 OG,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h,加入CCK-8溶液，继续培养2 h,其余步骤同上。

2.6用细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力[10]10]

在细胞消化和再悬浮后，对细胞进行计数。按照每孔2 500个细胞的密度接种到6孔板中，每组设3个双孔。每孔补充培养基2 mL,在5%CO2和37℃的培养箱中培养10 d。当板中出现可见克隆时，弃掉培养基，用PBS清洗2次；4%多聚甲醛固定15 min,干燥后，0.1%结晶紫染色15 min,自来水冲洗3次，晾干后拍照。

2.7用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力[11]11]

将细胞以1×106 cell·mL-1的密度接种至6孔板，每孔2 mL,待细胞铺满孔底面积后，用200μL无菌枪头在孔底标记线划痕，PBS清洗3次，记录划痕初始状态，培养24 h后，拍照记录划痕愈合情况，用Image J软件分析划痕面积，计算细胞迁移率。

3、统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x¯±s表示，2组间比较用配对样本t检验；计数资料用率表示，比较用χ2检验。

二、结果

1 CLPTM1L蛋白在结肠癌组织和正常结肠组织中的表达情况

在癌组织中CLPTM1L的染色强度显著高于癌旁组织，见图1。在癌组织和癌旁组织中CLPTM1L高表达率分别为66.67%(58例/87例)和36.78%(32例/87例),差异有统计学意义(P<0.05)。

2细胞实验的结果

2.1构建CLPTM1L过表达细胞株

对照组和实验组的CLPTM1L蛋白相对表达水平分别为0.16±0.07和0.81±0.21,差异有统计学意义(P<0.05),见图2A,这提示成功构建CLPTM1L过表达细胞株。

2.2过表达CLPTM1L增强结肠癌细胞的增殖能力

CCK-8实验显示：与对照组相比，实验组的细胞增殖速度变快，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。细胞克隆实验结果显示：实验组和对照组的细胞染色面积分别为1.08×105±1 473.63和(7.12±1.44)×104,差异有统计学意义(P<0.05),见图2B。这表明过表达CLPTM1L会增强结肠癌细胞的增殖能力。

2.3过表达CLPTM1L增强结肠癌细胞的迁移能力

实验组和对照组的24 h细胞迁移率分别为(47.75±2.76)%和(28.41±2.53)%,MMP-2蛋白相对表达水平分别为0.93±0.05和0.41±0.11,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图2C和2D。这表明过表达CLPTM1L会通过提高MMP-2的表达，进而增强结肠癌细胞的迁移能力。

图1唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白(CLPTM1L)在结肠癌组织和癌旁组织中的表达情况(免疫组化法，×400)

图2过表达CLPTM1L对结肠癌细胞增殖、迁移和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响

表1过表达CLPTM1L对HCT116细胞增殖的影响(x¯±s)

2.4 OG可以下调CLPTM1L

低、中、高剂量实验组和空白组的CLPTM1L蛋白相对表达水平分别为0.79±0.05、0.71±0.13、0.51±0.13和0.92±0.04,见图3A。与空白组相比，低、中、高剂量实验组的CLPTM1L蛋白相对表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。这表明OG可以下调CLPTM1L的表达，并呈药物浓度依赖性。

图3没食子酸辛酯(OG)的作用

2.5 OG可以抑制HCT116细胞的增殖能力与CLPTM1L相关

CCK-8实验显示：OG可抑制HCT116细胞的增殖能力，其作用呈浓度依赖性(P<0.05,见表2),并且在同一个药物浓度作用下，实验组的细胞存活率明显高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05,见表3),表明OG可以抑制HCT116细胞的增殖能力，并与CLPTM1L相关。

2.6 OG可以抑制HCT116细胞的迁移

细胞划痕实验显示：低、中、高剂量实验组和空白组的24 h细胞迁移率分别为(17.62±5.48)%、(11.80±3.74)%、(3.77±3.91)%和(26.25±1.57)%。与空白组比较，低、中、高剂量实验组的24 h细胞迁移率均显著低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05),见图3B。这表明OG可以抑制HCT116细胞的迁移，并呈浓度依赖性。

表2以细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测OG对HCT116细胞增殖的影响(x¯±s)

表3不同浓度OG对对照组和实验组存活率的比较(%,x¯±s)

三、讨论

CLPTM1L在卵巢癌、肺癌、胰腺癌、食管癌等肿瘤的发生发展过程中发挥重要调节作用。ZHANG等[12]研究发现，miR-494通过靶向CLPTM1L来调控食管鳞状细胞癌细胞生长、侵袭和凋亡。PUSKÁS等[13]研究发现，抑制CLPTM1L可以减弱吉西他滨导致的胰腺肿瘤细胞中CLPTM1L和p110α的物理相互作用，用抗CLPTM1L进行体内治疗能有效地抑制肺癌和胰腺癌异种移植的生长。上述研究均提示CLPTM1L是一个与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移密切相关的蛋白。

本研究首先用多样本免疫组化证实，CLPTM1L蛋白在结肠癌组织中呈现高表达，提示CLPTM1L基因可以促进结肠癌的进展。功能学实验表明：过表达CLPTM1L基因后，结肠癌HCT116细胞的增殖和迁移能力均明显增强，并显著上调MMP-2蛋白的表达。研究发现，MMP-2主要参与细胞外基质蛋白水解[14]。基于相关报道，本课题组认为CLPTM1L很有可能通过MMP-2调节肠癌细胞的侵袭能力，用抗CLPTM1L可能对CLPTM1L高表达的结肠癌患者具有治疗作用。同时，本研究结果显示：经OG处理后的HCT116细胞内CLPTM1L蛋白水平下降，细胞活力和迁移能力均受到显著的抑制，且呈浓度-时间依赖性。

因此，CLPTM1L在结肠癌组织中高表达，过表达CLPTM1L显著增强结肠癌细胞的增殖和迁移能力，其迁移机制可能与调节MMP-2表达相关，而OG可以靶向CLPTM1L治疗结肠癌。

参考文献:

[5]陈洁,耿慧武,王凤杰,等.FoxO1蛋白在癌细胞质中的差异表达及其功能研究[J]安徽医科大学学报,2021,56(12):1847-1852.

[6]郭银谋,王玉梅,陈贡斌,等.miR-3619-5p靶向PFKFB3抑制结肠癌细胞的增殖､迁移和侵袭[J].现代免疫学,202141(6):487-494.

[8]孙亦鹏,倪振华,吴颖颖,等过表达CLPTM1L降低95-D肺癌细胞对吉西他滨的敏感性[J]实用肿瘤学杂志,2019,33(6):486-49

[9]敖丽,王凯,鲁晓岚,等荧光显微镜联台CCK8法测定原花青素B2对胃癌细胞自噬和凋亡的影响[J]中国医疗设备,2020,35(S1):82-84.

[10]朱奕,刘宏伟,柳建军.TSHZ3在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞生物学功能的影响[J]现代肿瘤医学,2022,30(16):.2880-2885.

[11]江育莹,包旭,李宏,等化合物ZWF对A549细胞迁移､细胞周期和凋亡的作用[J]华西药学杂志,2020,35(2):167-170.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81873137);

文章来源:章京,倪振华,殷佩浩.没食子酸辛酯通过调节唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白影响结肠癌细胞的生物学功能研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(13):