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粪便miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌筛查的诊断价值

2023-08-21 206 上传者：管理员

摘要：探讨粪便miRNA675-5p联合qFIT在结直肠癌筛查中的诊断价值。方法纳入2016年1月至2021年12月于武汉科技大学附属天佑医院和十堰市太和医院就诊的173例患者，收集其临床资料及粪便标本，包括48例结直肠癌组、46例腺瘤组、42例息肉组、37例正常对照组。采用qRT-PCR法检测粪便miRNA675-5p,定量粪便免疫化学检测(qFIT)检测粪便潜血。采用ROC曲线评估qFIT及miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌及腺瘤的诊断价值。结果结直肠癌组的qFIT值[259.94(36.25,758.55)]明显高于腺瘤组[0(0,13.42)]、息肉组[0(0,0)]、正常对照组[0(0,0)],差异有统计学意义(均P<0.01);腺瘤组高于息肉组和正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结直肠癌组qFIT敏感度为85.4%,特异度为100%;腺瘤组qFIT敏感度为28.3%,特异度为97.3%。联合检测(miRNA675-5p联合qFIT)结直肠癌组敏感度100%,特异度89.2%;腺瘤组敏感度71.7%,特异度86.5%。结直肠癌组、腺瘤组联合检测优于qFIT单独检测，差异有统计学意义(均P<0.01)。结论 miRNA675-5p联合qFIT检测能够提高早期结直肠癌筛查诊断效能。

关键词：
CRC人群筛查
miRNA675-5p
侵入性检查
定量粪便免疫化学检测
结直肠癌
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球发病率和死亡率前3位的癌症[1],因其起病隐匿、发病缓慢，早期筛查使得它成为可以预防和治愈的疾病，降低其死亡率，减少经济负担[2]。目前CRC的早期诊断方法分为侵入性检查和非侵入性检查。侵入性检查主要是肠镜检查，是CRC诊断的金标准，但并不推荐用于CRC人群筛查的首选[3,4]。非侵入性检查包括实验室检查(粪便样本、血液样本)和影像学检查，其中定量粪便免疫化学检测(quantitative fecal immunochemical test, qFIT)和粪便分子检测备受关注。qFIT利用血红蛋白抗原抗体反应的原理进行检测下消化道出血，不受饮食或药物影响，适用于人群筛查[5],但对结肠腺瘤的敏感度及特异度不高。miRNA在结直肠癌的发生发展中起重要作用，可以用于CRC的早期诊断[6]。研究显示miRNA675-5p在CRC发生发展中具有重要作用[6],在癌组织中和CRC患者血液中高表达[7,8]。血清miR-675有可能作为CRC早期检测和预后预测的生物标志物[9]。为进一步提高检测的特异度和敏感度，可以进行联合检测，对结直肠癌患者、腺瘤患者、息肉患者及正常对照组的粪便样本进行miRNA675-5p联合qFIT检测，评估其在结直肠癌筛查中的应用价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2016年1月至2021年12月于武汉科技大学附属天佑医院、十堰市太和医院就诊的经结肠镜和活组织检查确诊的48例结直肠癌、46例腺瘤、42例息肉患者的临床资料和粪便标本。此外选取37例健康人作为正常对照组。纳入标准：(1)医院病理检查明确诊断为结直肠癌、腺瘤、息肉；(2)肿瘤患者均为首次确诊病例，无复发；(3)收集粪便标本前未行相关药物治疗或侵入性肠道操作。排除标准：(1)肿瘤患者检查前已接受手术或放化疗等；(2)曾行肠道手术，患有自身免疫性疾病或一些消化系统的器质性疾病如炎症性肠病，肠结核等；(3)因各种原因未行结肠镜检查者；(4)粪便为水样便或未按照要求留便；(5)合并其他恶性肿瘤。结直肠癌组中男27例，女21例，年龄(63.46±13.29)岁(范围：33～86岁);腺瘤组中男31例，女15例，年龄(62.52±10.04)岁(范围：43～86岁);息肉组中男29例，女13例，年龄(59.9±6.86)岁(范围：48～74岁);正常对照组中男8例，女29例，年龄(29.19±18.74)岁(范围：18～77岁)。结直肠癌组、腺瘤组、息肉组在性别和年龄方面差异无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。本研究中所有研究对象均自愿参加并签署知情同意书，该研究方案经本院伦理委员会审批通过(伦理号：201512、LL-2022-11-28-01)。

1.2研究方法

在术前或内镜检查前留取约2～5 g粪便放入粪便收集器中，放置-80℃冰箱留存，用于miRNA的提取检测，并用qFIT采便器留取粪便标本进行qFIT检测。本实验所有结肠镜检查由具有高级职称的内镜医师开展。若镜下发现异常病变，均取组织活检以明确病理诊断，并记录相应病变的大小、颜色、形态、数目、与周围组织关系等。根据结肠镜和活组织病理检查结果，分为结直肠癌组、腺瘤组、息肉组和正常对照组。

1.3 miRNA675-5p的检测方法

1.3.1主要仪器和试剂

科鹿(武汉)生物科技有限公司生产的核酸提取试剂盒(EP014)、核酸纯化试剂盒(EP013)、第一链cDNA合成试剂盒(EQ003),EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix,荧光定量PCR仪(QuantStudio 6 Flex)购自美国生命技术公司。荧光定量PCR所用引物为武汉恒意赛生物科技有限公司合成，引物序列：miRNA675-5p上游引物：5′-CTTGGTGCGGAGAGGGC-3′,下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′;内参基因U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游引物：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.3.2 qRT-PCR检测

Trizol法提取总RNA,逆转录成cDNA,产物用于qRT-PCR扩增。实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTM Real-Time PCR仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix试剂盒进行(ELK Biotechnology, EQ001)。反应体系为：2×Master Mix 5.0μL,引物工作液(2.5μmol/L)1.0μL,Template 1.0μL,ddH2O 2.0μL,Rox 1.0μL。反应程序为：预变性95℃,3 min, 95℃,10 s→58℃,30 s→72℃,30 s,循环(40次)。反应结束后生成荧光定量值动态曲线，分析显示结果及循环阈值(Ct)。对照为U6基因。采用F=2-ΔΔCt法分析比较目的基因在结直肠癌、腺瘤、息肉及正常对照组粪便中的表达。ΔΔCt=(Ct miRNA675-5p-CtU6)实验组-(Ct miRNA675-5p-CtU6)对照组。

1.4 qFIT检测方法

1.4.1主要仪器和试剂

高敏定量粪便血红蛋白检测系统专用机(FC-100B)、采便管、大便隐血试剂。

1.4.2 qFIT检测

严格按照要求及说明书进行qFIT检测，结果<10μg/g为阴性，≥10μg/g以具体数值表示；两份检测结果取最大值为最终结果。

1.5统计学方法

应用SPSS 26.0统计学软件，符合正态分布的计量资料以x¯±s表示，组间均数比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的用中位数M(P25,P75)表示，采用Mann-Whitney U秩和检验。绘制ROC曲线，得出曲线下面积，应用约登指数，算出截断值和敏感度、特异度。计数资料组间比较采用卡方检验，当理论频数T≥5时，采用非连续校正检验；当1≤T<5用连续校正检验；当T<1时，用Fisher’s确切概率法检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组qFIT检测

结直肠癌组的qFIT值[259.94(36.25,758.55)]明显高于腺瘤组[0(0,13.42)]、息肉组[0(0,0)]、正常对照组[0(0,0)](均P<0.01),腺瘤组高于息肉组和正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);息肉组和正常对照组差异无统计学意义(P=0.365)。如表1所示。

表1各组qFIT检测结果比较

2.2 qFIT检测对结直肠癌、腺瘤的诊断价值

将结直肠癌组、腺瘤组分别与正常对照组比较，利用ROC诊断模型，绘制结直肠癌组qFIT的ROC曲线，得出AUC:0.925,95%CI(0.864,0.987),应用约登指数算出，当qFIT的截断值为21.435 ug/g时，其预测肠癌的敏感度为85.4%(41/48),特异度为100%(37/37),约登指数为0.854(图1)。腺瘤组qFIT的ROC曲线，得出AUC:0.630,95%CI(0.511,0.749)。应用约登指数算出，当qFIT的截断值为5.39μg/g时，其预测腺瘤的敏感度为28.3%(13/46),特异度为97.3%(36/37),约登指数为0.256(图2)。

2.3 miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌、腺瘤的诊断价值

将结直肠癌组、腺瘤组分别与正常对照组比较，利用ROC诊断模型，绘制结直肠癌组联合检测(miRNA675-5p联合qFIT)的ROC曲线的AUC:0.993,95%CI(0.945,1.000)(图3),联合检测对结直肠癌诊断的敏感度100%(48/48),特异度89.2%(33/37)。腺瘤组联合检测(miRNA675-5p联合qFIT)的ROC曲线，得出AUC:0.897,95%CI(0.810,0.953)(图4)。联合检测对腺瘤诊断的敏感度71.7%(33/46),特异度86.5%(32/37)。结直肠癌组联合检测ROC曲线的AUC(0.993)值高于qFIT单独检测AUC值(0.925)(P<0.01)。腺瘤组联合检测AUC(0.897)值明显高于qFIT单独检测AUC值(0.630)(P<0.01)。如表2。

图1结直肠癌组qFIT检测ROC曲线

图2腺瘤组qFIT检测ROC曲线

图3结直肠癌组miRNA675-5p联合qFIT检测ROC曲线

表2结直肠癌组、腺瘤组联合检测和qFIT检测曲线下面积的比较

图4腺瘤组miRNA675-5p联合qFIT检测ROC曲线

2.4 qFIT检测与结直肠癌临床病理特征的相关性分析

从病历系统查询患者的临床资料，将肠癌患者按照年龄分为≤60岁和>60岁组。按照性别分为男性、女性。按照分化程度分为高、中、低组。按照肿瘤的部位分成结肠组(左半结肠，右半结肠)和直肠组。按照Dukes分期分为A、B期和C、D期。本研究以qFIT中位数259.94为截断值，将结直肠癌组48例患者分成高表达组、低表达组。应用χ2检验，结果表明qFIT检测值与年龄、性别、肿瘤发生部位、分化程度、Dukes分期均无明显相关性(均P>0.05)。如表3。

表3 qFIT值与结直肠癌临床病理特征的关系

3、讨论

结直肠癌(CRC)是作为可以预防的疾病，早期筛查是至关重要的，虽然结肠镜是诊断结直肠癌最有效的方法，但不适合于人群筛查。粪便免疫化学检测(fecal immunochemical test, FIT)是目前国内外推荐结直肠癌筛查的首选检查[3],其原理是检测粪便中的人类血红蛋白含量。研究表明FIT可减少34%的结直肠癌发生率及40%的结直肠癌死亡率，远端结肠发病率和死亡率下降均高于近端结肠(发病率39%vs.16%和CRC死亡率44%vs. 28%)[5]。FIT分为定性和定量FIT(qFIT)。定性FIT具有不稳定性和主观性，且检测下限较高，导致出血量较少的病变漏诊。qFIT是一种自动化的、批量处理的、基于实验室的定量分析方法，其检测下限值为10μg/g,低于定性法检测下限，可更加客观、稳定、迅速地获取检测结果，更加适合于大样本的人群筛查。并且截断值越低，越能筛查出出血量较少的肠道病变，可以提高腺瘤检出率，优于定性FIT,目前在国内大规模人群筛查中应用较少[4]。本研究中qFIT预测结直肠癌和腺瘤的敏感度为85.4%和28.3%。与文献报道[10]的qFIT检测肠癌和腺瘤的敏感度(56.3%～81.3%和13%～30.5%)相一致。本研究qFIT预测结直肠癌和腺瘤的曲线下面积分别为0.925,0.630,与Imperiale等[11]的研究结果相似(肠癌AUC:0.89,腺瘤AUC:0.67)。虽然FIT是目前应用最广泛的CRC筛查手段，但它对早期的CRC和腺瘤的敏感度相对较低[12]。此外，一些因素可能会影响FIT检测结果并导致假阳性，一项荟萃分析表明女性与男性相比，假阳性率明显更高。有消化性溃疡和肛裂病史的患者由于出血风险较高，也往往有假阳性结果，且使用NSAIDs药物(如阿司匹林)可能导致较高的假阳性率[13,14]。癌症筛查必须有足够的敏感度，因为它的主要目标是筛出癌前病变和早期癌症。大约85%的结直肠癌病变源于腺瘤。因此，有效地检测腺瘤是CRC筛查的关键，同时需要提高腺瘤检出敏感度，为了弥补FIT的缺陷，可以进行联合检测来提高癌前病变和早期癌症检出率。

microRNA(miRNA或微小RNA)被认为在肿瘤细胞的异常基因表达中起重要作用，并且具有细胞类型和疾病特异性，因此可能是很好的诊断性生物标志物[15]。粪便miRNA的检测近年来被认为是一种潜在的更有效的筛查方法，具有较高的敏感度和特异度，特别是对于诊断早期CRC和肿瘤前病变。

本研究共纳入48例结直肠癌患者，仅有24例有手术标本的病理组织报告，可以进行分期，其中有14例A、B期，10例C、D期。另外将年龄、性别、分化程度、肿瘤发生部位进行比较，结果显示qFIT在结直肠癌组的表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤部位均无明显相关性(均P>0.05)。

当然本研究纳入的样本量较少，可能存在偏倚，未来可进行多个不同地域的多中心研究，进一步验证miRNA675-5p联合qFIT对结直肠腺瘤的筛查价值，从而降低结直肠癌的发生率，真正使结直肠癌成为一种可治愈的疾病。

综上所述，本研究将miRNA675-5p和qFIT进行联合检测，用于诊断CRC和腺瘤的AUC均高于单独检测，且诊断效能较高，因此，粪便miRNA675-5p和qFIT联合检测为CRC早期无创诊断提供了一种新的筛查策略。

参考文献:

[4]国家消化系统疾病临床医学研究中心(上海),国家消化道早癌防治中心联盟,中华医学会消化内镜学分会,等.中国早期结直肠癌筛查流程专家共识意见(2019,上海)[J]中华消化内镜杂志,2019,36(10):

[6]周广琛,刘怡希,郑云结直肠癌和microRNA:研究进展[J]中国临床药理学与治疗学,2022,27(5):

[14]王德钱,向敏,盛玉程,等.ATIC在结直肠癌中的临床价值及对其细胞生物学功能的影响[J].华中科技大学学报:医学版,2022,51(3):334-340

基金资助:2021年度职业危害识别与控制湖北省重点实验室开放基金项目(No.OHIC2021G03);

文章来源:陈洁,王阳,金曙等.粪便miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌筛查的诊断价值[J].华中科技大学学报(医学版),2023,52(04):540-544.