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结直肠癌组织中淋巴增强子结合因子1(LEF1)高表达及其临床意义

2024-02-21 221 上传者：管理员

摘要：目的:探讨结肠癌患者癌组织中淋巴增强子结合因子1(lymphatic enhancer binding factor 1,LEF1)的表达水平及其临床意义。方法:免疫组化染色法结合Western blot观察结肠癌患者癌组织和癌旁组织中LEF1的表达情况，并对癌组织中LEF1的表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性进行统计学分析。Kaplan-Meier生存分析LEF1的表达与结肠癌患者预后的关联，多因素COX回归分析影响结肠癌患者生存预后的危险因素。进一步分析TCGA数据库结肠癌患者癌和癌旁组织中LEF1的表达水平，及其表达与患者预后以及淋巴结转移的相关性。此外，细胞水平采用Western blot检测结肠癌细胞系中LEF1的蛋白表达情况，并通过转染LEF1 siRNA观察对结肠癌HCT116细胞生物学功能的影响。结果:结肠癌组织中LEF1的表达较癌旁组织显著增加(P<0.05),且其表达水平与肿瘤病理分期、分化程度和淋巴结转移呈正相关(P<0.05),与患者年龄、病理类型无关(P>0.05)。LEF1高表达结肠癌患者的生存期明显低于低表达患者(P<0.05)。多因素COX回归分析结果显示，LEF1高表达、肿瘤病理分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移是结肠癌患者不良预后的危险因素(P<0.05)。TCGA数据库分析结果显示，结肠癌组织中LEF1的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05),且其表达水平与患者预后呈负相关(P<0.05),而与患者淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。此外，细胞实验结果显示，人结肠癌细胞系中LEF1的表达水平显著高于正常结肠上皮细胞(P<0.05),敲减LEF1可有效降低结肠癌HCT116细胞的迁移和侵袭能力，并抑制Wnt/β-catenin信号通路活性(P<0.05)。结论:LEF1高表达与结肠癌患者的短生存期和不良预后密切相关，可作为结肠癌患者术后复发和转移以及临床预后的重要生物标志物。

关键词：
LEF1
危险因素
淋巴转移
生物标志物
结肠癌
预后
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结肠癌(colon cancer, CA)是致死率极高的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的重要原因[1,2]。据报道全球每年新增结肠癌患者50万例，死亡人数高达26万例[3]。目前患者临床诊疗仍以手术切除联合放化疗为主。近年来随着个体化靶向药物和免疫检查点抑制剂的深入研究及其在临床结肠癌患者治疗中的应用，一定程度增强了结肠癌患者的临床疗效并改善了预后生存[4,5]。然而肿瘤患者较长的治疗周期和频繁的药物使用极易产生治疗抵抗或脱敏效应导致药物的临床应用受限[6]。因此，深入研究结肠癌的病因及其机制对其早期诊断和治疗至关重要。淋巴增强子结合因子1(lymphatic enhancer binding factor 1,LEF1)编码基因位于染色体4q25,其编码蛋白通过结合并激活T细胞受体，在细胞生长分化等生理病理进程中发挥重要作用[7,8]。大量研究表明LEF1在肺癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]、淋巴癌[12]等恶性肿瘤中表达上调，通过激活Wnt/β-catenin、SRPK1/GSK3β和Notch等途径，诱导肿瘤细胞上皮间质转化和侵袭转移。本研究旨在探讨结肠癌中LEF1的表达水平及其高表达与患者预后的关联和临床意义。

1、资料与方法

1.1 临床资料

收集2018年09月至2020年12月期间我院结直肠肛门外科就诊且经临床病理检查确诊的90例结肠癌患者为观察对象，男性50例，女性40例，年龄35～70岁，平均(52.13±6.45)岁。肿瘤位置：左半结肠49例，右半结肠41例；病理分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期44例，Ⅲ期32例；分化程度：高分化33例，中分化40例，低分化17例；肿瘤类型：鳞癌59例，腺癌31例。所有患者严格按照临床结肠癌诊断标准纳入[13]。排除标准：①排除术前接受新辅助放化疗、抗血管生成以及免疫治疗等药物的患者；②排除肝肾功损伤以及伴有严重精神疾病和慢性病的患者；③排除伴有其他恶性肿瘤的患者；④排除临床资料不全的患者。本研究获得医学伦理委员会批准，所有患者研究前均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 结肠癌及癌旁组织中LEF1的表达水平检测

收集结肠癌患者的癌和癌旁组织，制备冰冻切片后依次进行脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶封闭、0.5%Triton X-100透膜、10%山羊血清封闭后，采用LEF1一抗稀释液(1∶50)及其对照溶液4 ℃孵育过夜。次日，采用1∶5 000稀释的羊抗兔IgG二抗室温孵育30 min后，依次进行DAB染液显色，苏木素复染细胞核、梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，显微镜下观察LEF1的表达水平。采用RIPA裂解液提取癌和癌旁组织的总蛋白，采用BCA试剂盒定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳，经ECL化学发光试剂显色后，采用Bio-Rad凝胶成像系统检测LEF1的蛋白表达。

1.2.2 LEF1表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性分析

Spearman等级相关分析法分析LEF1的表达水平与临床结肠癌患者的肿瘤位置、病理分期、分化程度以及病理类型等不同病理特征的相关性。

1.2.3 LEF1表达与结肠癌患者预后的关联

Kaplan-Meier(K-M)法分析LEF1表达与临床结肠癌患者生存预后的关联。

1.2.4 多因素COX回归分析结肠癌患者生存预后的危险因素

多因素COX回归分析法分析影响临床结肠癌患者生存预后的危险因素。

1.2.5 分析TCGA数据库结肠癌组织中LEF1的表达与患者预后的关联

下载TCGA数据库结肠癌患者癌和癌旁组织中差异表达基因的mRNA数据，并分析LEF1的表达差异及其与患者临床预后以及淋巴转移的相关性。

1.2.6 敲减LEF1对结肠癌细胞生物学功能的影响

采用Western blot检测人结肠癌细胞系(HCT116细胞和SW620细胞)和人正常结肠上皮NCM460细胞中LEF1的蛋白表达情况。随后，按照High gene transfection试剂盒说明书对HCT116细胞转染LEF1 siRNA,并采用Transwell和Western blot实验观察敲减LEF1对细胞迁移、侵袭以及Wnt/β-catenin信号通路标志分子蛋白表达水平的影响。

1.3 统计学方法

SPSS 22.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，计数资料以例数和百分率表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用χ2检验。所有统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 LEF1在结肠癌患者癌组织中高表达

免疫组化染色结果显示，LEF1在结肠癌患者癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(图1A,P<0.05);此外，Western blot结果显示，与癌旁组织相比，结肠癌患者癌组织中LEF1的蛋白表达上调了2.37倍(图1B,P<0.01)。

图1 结肠癌患者癌和癌旁组织中LEF1的表达分析

2.2 LEF1表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性分析

Spearman等级相关分析结果显示，LEF1的表达与结肠癌患者的病理分期、分化程度和淋巴转移呈正相关 (P<0.001),肿瘤组织病理分期越高、分化程度越低和淋巴结转移能力越强，LEF1的表达越高(P<0.05),而与患者年龄和病理类型无关(P>0.05),见表1。

表1 LEF1表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性

2.3 LEF1表达与结肠癌患者生存预后的关联

通过对受试结肠癌患者进行24个月的电话随访，随访期间患者共死亡21例，总生存率为76.67%(69/90)。其中低LEF1表达组43例(随访期间死亡6例，生存37例),高LEF1表达组47例(随访期间死亡15例，生存32例)。高LEF1表达组生存率为68.09%(32/47),明显低于低LEF1表达组的86.05%(37/43), 差异有显著统计学意义(χ2=4.132,HR=1.79,95%CI=1.17～2.79,P=0.024<0.05)。

2.4 多因素COX回归分析结肠癌患者生存预后的危险因素

以结肠癌患者的生存情况为因变量(赋值1=死亡，0=生存),纳入患者临床分期(赋值1=I期，2=Ⅱ期，3=Ⅲ期)、分化程度(赋值1=高分化，2=中分化，3=低分化)、淋巴结转移(赋值1=发生淋巴转移，0=未发生淋巴转移)、LEF1(赋值1=高表达，2=低表达)为自变量，多因素COX回归分析结果显示，LEF1高表达、肿瘤病理分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移是结肠癌患者生存预后的危险因素(P<0.05),见表2。

2.5 TCGA数据库结肠癌组织中LEF1高表达且与患者预后呈负相关

为了深入探究结肠癌组织中LEF1的表达情况，本研究进一步分析了TCGA数据库中LEF1的表达水平及其与结肠癌患者临床预后的关联。结果显示，LEF1在TCGA数据库结肠癌组织中的表达较癌旁组织上调了7.83倍(图2A,P<0.001),且其高表达与患者预后呈负相关(图2B,P<0.001),而与患者临床病理分期(图2C)和淋巴结转移(图2D)呈正相关(P<0.001)。综上所示，LEF1可作为临床结肠癌患者预后的重要指标。

表2 结肠癌患者生存预后的危险因素分析

2.6 敲减LEF1抑制结肠癌细胞的恶性生物学进程

为了进一步揭示LEF1异常高表达对结肠癌发生发展的影响。本研究通过细胞水平验证了LEF1的表达情况(图3A),结果显示，与人正常结肠上皮NCM460细胞相比，人结肠癌HCT116细胞和SW620细胞中LEF1的蛋白表达分别上调了4.17倍和3.22倍(P<0.01)。Western blot结果显示，敲减LEF1可显著抑制Wnt/β-catenin信号通路标志分子Wnt5a和p-β-catenin的蛋白表达，且不影响β-catenin的总蛋白水平(P<0.05,图3B)。此外，敲减LEF1的HCT116细胞的迁移和侵袭能力较NC组分别下降了62.48%(P<0.01)和59.33%(P<0.01,图3C-D)。综上所述，沉默LEF1可显著抑制结肠癌细胞的恶性进程。

图2 LEF1表达水平与结肠癌患者预后的关联

图3 LEF1对结肠癌细胞恶性生物学进程的影响

3、讨论

结肠癌是严重威胁我国居民生命健康的恶性肿瘤之一。据国家癌症中心2022年数据显示，我国结直肠癌发病率和死亡率分别以每年2.4%和1.3%的幅度快速升高，目前年新发和死亡病例分别为40.8万和19.5万例，分别占我国癌症发病和死亡总数的10.04%和9.12%,严重威胁人民生命安全[14]。随着国内结肠癌筛查的普及促使早期预防成为可能。但针对转移性和复发性结肠癌患者仍缺乏有效治疗手段[15]。深入探究结肠癌的发病机制和寻找新诊疗手段，对于临床该类患者的个体化治疗具有重要意义。

LEF1是高迁移率家族成员，通过调控DNA螺旋结构参与基因表达调控，在细胞分化和恶性肿瘤的发生、发展进程中发挥重要作用。大量临床和基础研究表明，LEF1在食管癌[16]、肝癌[17]、前列腺癌[18]和宫颈鳞癌[19]等多种恶性肿瘤中异常高表达，可促进肿瘤的发生发展，并与患者的不良预后呈正相关。本研究结果显示，LEF1在临床结肠癌患者癌组织中异常高表达，且其高表达与结肠癌患者较高的肿瘤病理分期、低分化等级和淋巴结转移密切相关，提示LEF1高表达促进结肠癌的发生发展。此外，本研究通过生存分析发现，LEF1高表达的结肠癌患者生存预后较差，提示LEF1是结肠癌患者生存预后的独立危险因素，可作为重要的预后标志物和潜在治疗靶点。进一步对TCGA数据库结肠癌患者癌组织中LEF1的表达进行分析，结果表明，LEF1异常高表达与结肠癌患者的预后呈负相关，而与患者的临床病理分期和淋巴结转移呈明显正相关，且上述研究结果与临床结肠癌患者癌组织样本检测结果相一致。此外，进一步通过细胞实验揭示了结肠癌细胞中LEF1的表达水平显著上调，敲减LEF1能够有效抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭，上述研究结果表明LEF1异常高表达与结肠癌细胞的恶性生物学行为密切相关，可作为抗结肠癌细胞侵袭和转移的潜在作用靶点。

文献调研发现LEF1的促癌作用可能与调控结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的异常活化有关。Wnt/β-catenin信号通路已被证实参与多种恶性肿瘤的侵袭转移进程。研究表明LEF1是Wnt/β-catenin信号通路的下游关键效应分子，参与肿瘤细胞干性维持和诱导细胞的EMT进程[20]。深入研究发现LEF1表达增加可诱导肿瘤细胞EMT,降低E-cadherin表达，同时上调N-cadherin表达，导致肿瘤细胞黏附力降低，进而加速肿瘤转移。此外，研究报道LEF1表达升高可上调癌基因ERK表达，激活MAPK/ERK信号通路，诱导肿瘤细胞的过度增殖[21]。另有研究证实，靶向抑制LEF1可有效逆转肿瘤细胞的干性特征，进而抑制肿瘤的恶性发展[22]。本研究结果显示，敲减LEF1能够有效抑制Wnt/β-catenin信号通路标志分子的蛋白表达，进而诱导该信号通路失活。因此，本研究证实LEF1是一种促癌基因，其表达上调可促进结肠癌的恶性进展。

综上所述，结肠癌组织和细胞中LEF1高表达与患者病理分期、分化程度和淋巴结转移呈正相关，LEF1高表达、肿瘤病理分期、分化程度和淋巴结转移是结肠癌患者生存预后的独立危险因素，其中结肠癌患者癌组织中LEF1的表达检测是判断其预后的重要生物标志物，但LEF1的临床应用价值仍需多中心、大样本深入探究。

参考文献:

[4]陶凯雄.结肠癌新辅助治疗研究进展与思考[J].腹部外科,2023,36(2):83-87.

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[19]汪钊,王艳峰,关兵兵.β-catenin､LEF1在宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):3061-3065.

[20]郭玉霞,马利国,陈递林,等.Wnt信号通路中β-catenin､GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及其意义[J].山西医科大学学报,2015,46(8):773-776.

[22]崔婷婷,谢楠,张小莉,等.LEF-1的调控及其与肿瘤的关系研究进展[J].生命科学,2012,24(5):439-443.

基金资助:河北省重点研发计划(编号:22377786D);

文章来源:杨晓宇,屈明,武雪亮等.结直肠癌组织中淋巴增强子结合因子1(LEF1)高表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(05):878-882.