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二十二碳六烯酸抑制人结肠癌细胞系HT-29增殖

2024-08-01 152 上传者：管理员

摘要：目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对人结肠癌细胞系HT-29的影响及其作用机制。方法将人结肠癌细胞系HT-29分为对照组，25、50和100μmol/L DHA处理组，以及100μmol/L DHA+30μmol/L 740Y-P处理组。MTT检测HT-29细胞增殖，annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白以及p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达，RT-qPCR检测NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA相对表达量。结果与对照组相比，DHA 25、50和100μmol/L处理HT-29细胞后细胞存活率下降(P<0.05或P<0.01)，细胞凋亡率增加(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05),PI3K、Akt和m TOR的磷酸化水平均下降(P<0.05或P<0.01),NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA相对表达量均下降(P<0.05或P<0.01)。此外，DHA 100μmol/L和740Y-P 30μmol/L共同处理HT-29细胞后，细胞生存率、蛋白磷酸化水平(p-PI3K、p-Akt和p-mTOR)、mRNA相对表达量(NLRP3、Caspase 1和IL-1β)均低于对照组(P<0.05)和740Y-P 30μmol/L组(P<0.05)，而高于DHA 100μmol/L组(P<0.05或P<0.01)。结论 DHA抑制人结肠癌细胞系HT-29增殖，作用机制可能与抑制PI3K/Akt/m TOR和NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号分子通路有关。

关键词：
NOD样受体pyrin结构域相关蛋白3(NLRP3)
PI3K/Akt/m TOR
二十二碳六烯酸
细胞增殖
结肠癌
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结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，发生发展和膳食关系密切，尤其与多不饱和脂肪酸(poly unsaturated fatty acids,PUFAs)的摄入相关。长期摄入ω-3 PUFAs的人群结直肠癌发生风险明显低于普通人群[1]。二十二碳六烯酸(DHA)是ω-3 PUFAs的一种，具有多种药理作用，尤其在抗肿瘤方面。多项研究表明，DHA抑制多类型肿瘤细胞增殖、迁移以及诱导凋亡，包括胃癌、肝癌和乳腺癌，也可抑制人结直肠癌细胞系增殖和促凋亡[2]，但作用机制尚不明确。

肿瘤组织中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路的分子异常过表达，发挥促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡的作用[3]。NOD样受体pyrin结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)是一种胞质多聚体蛋白复合物，参与肿瘤和代谢性疾病的发生发展。最近，NLRP3过表达在肠癌组织中被发现，且敲低肠癌细胞内NLPR3表达后肿瘤细胞增殖受到阻滞[4]。研究表明，NLRP3炎性小体活化部分依赖于PI3K/Akt通路[5]，因此PI3K/Akt/m TOR通路与NLRP3炎性小体活化可能存在调控关系，这为研究以PI3K/Akt/m TOR和NLRP3为靶点抗结直肠癌治疗提供新思路。本研究用DHA处理人结肠癌细胞系HT-29，探讨DHA对细胞增殖的影响以及阐述PI3K/Akt/m TOR和NLRP3分子通路在DHA抗结肠癌中的作用。

1、材料与方法

1.1细胞和主要试剂

人结肠癌细胞系HT-29 (赛百慷生物);DHA(上海源叶生物公司);MTT检测试剂盒(上海西格生物公司);Trizol试剂、RNA逆转录试剂、实时定量PCR试剂(Takara公司);annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD公司);PI3K激活剂740Y-P(MCE公司);Bcl-2、Bax、m TOR、p-m TOR、β-actin、GAPDH等抗体和生物素标记山羊抗小鼠/兔Ig G二抗(上海碧云天生物技术有限公司);PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt等抗体(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组:

将HT-29细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37℃、5%CO2,2～3 d传代1次。取对数期细胞，分为对照组(control),25,50和100μmol/L DHA处理HT-29组，以及100μmol/L DHA和/或30μmol/L PI3K激活剂740Y-P处理HT-29组。

1.2.2 MTT检测细胞存活率:

取对数期细胞，按照1.0×104个/孔细胞接种于96孔板，各组孵育HT-29细胞24 h，弃去培养板中的培养液。每孔加5 mg/m L MTT溶液20μL，孵育4 h后，弃去孔内培养液。每孔加150μL DMSO,37℃振荡15 min，结晶溶解后，用酶标仪检测490 nm波长处的A值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=100-[(1-处理组A值/对照组A值)]×100%。

1.2.3 annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡:

取对数期细胞，按照1.2×106个/孔细胞接种于6孔板，工作体积2 m L/孔。按0,25,50,100μmol/L分别处理HT-29细胞，24 h后收集细胞，预冷的PBS洗涤2次，调整细胞为1×106个/m L。加入500μL结合缓冲液，离心弃上清，再加入100μL结合缓冲液混匀后，分别加入5μL annexin V-FITC与10μL PI，充分混匀，室温避光反应15 min。最后加入400μL结合缓冲液，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.4 Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白及PI3K/Akt/m TOR分子通路蛋白的表达:

对数期的HT-29细胞接种于6孔板，含DHA和/或740Y-P的培养液孵育24 h，预冷的PBS清洗细胞，RIPA裂解缓冲液冰上裂解细胞，提取总蛋白。蛋白质样品经定量、电泳分离、转膜、5%脱脂牛奶封闭后，将膜与以下一抗在4℃下孵育过夜:Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶2 000)、m TOR(1∶1 000)、p-m TOR(1∶1 000)、β-actin (1∶2 000)，加入生物素标记山羊抗小鼠/兔Ig G抗体(1∶3 000)室温孵育2 h。加入ECL试剂，室温2 min，凝胶成像系统显影和拍照。

1.2.5 RT-q PCR法检测细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA相对表达量:

收集处理后的HT-29细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，将RNA逆转录为c DNA并作为模板行RT-q PCR。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列:NLRP3-F:5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3',NLRP3-R:5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3';Caspase 1-F:5'-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3',Caspase 1-R:5'-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3';IL-1β-F:5'-AT GATGGCTTATTACAGTGGCAA-3',IL-1β-R:5'-GTCG GAGATTCGTAGCTGGA-3';GAPDH-F:5'-TGACTT CAACAGCGACACCCA-3',GAPDH-R:5'-CACCCTGT TGCTGTAGCCAAA-3'。

1.3统计学分析

数据结果用均值±标准差表示，多组间计量资料若符合正态分布且符合方差齐性检验，用One-way-ANOVA单因素方差分析，组间两两比较采用Turkey检验;若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett's T3检验或独立样本t检验;若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。

2、结果

2.1 DHA抑制HT-29细胞增殖

与对照组比较，DHA 25、50和100μmol/L处理后HT-29细胞生存率降低且呈浓度依赖性降低(P<0.05或P<0.01)(图1)。

2.2 DHA诱导HT-29细胞凋亡

与对照组比较，DHA 25、50和100μmol/L处理HT-29细胞后细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)(图2)。

图1 HT-29细胞存活情况

图2 HT-29细胞凋亡情况

2.3 DHA对HT-29细胞Bcl-2、Bax蛋白表达影响

与对照组比较，DHA 25、50和100μmol/L处理HT-29细胞后促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低。Bcl-2/Bax比值对决定细胞是否进入凋亡状态具有重要意义。与对照组比较，各组Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01)(图3)。

2.4 DHA抑制PI3K/Akt/m TOR分子通路蛋白的表达

与对照组比较，DHA 25、50和100μmol/L处理HT-29细胞后p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达水平依次降低，PI3K、Akt和m TOR蛋白无明显变化(图4)。

2.5 DHA抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路分子mRNA表达

DHA 25、50和100μmol/L处理HT-29细胞后NLRP3、Caspase 1和IL-1βmRNA相对表达量均低于对照组(P<0.01)(图5)。

图3 DHA对HT-29细胞Bcl-2和Bax蛋白表达影响

图4 DHA对HT-29细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达的影响

2.6 740Y-P和/或DHA对HT-29细胞增殖的影响

DHA100μmol/L和740 Y-P 30μmol/L共同处理HT-29细胞后生存率显著低于对照组(P<0.01)和740Y-P 30μmol/L单独处理(P<0.05)，但显著高于DHA 100μmol/L单独处理(P<0.05)(图6)。

2.7 740Y-P和/或DHA对PI3K/Akt/m TOR分子通路蛋白表达的影响

DHA100μmol/L和740 Y-P 30μmol/L共同处理HT-29细胞后p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达水平均不同程度低于740Y-P 30μmol/L单独处理，但高于DHA 100μmol/L单独处理(图7)。

2.8 740Y-P和/或DHA对NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路mRNA表达的影响

DHA100μmol/L和740Y-P 30μmol/L共同处理HT-29细胞后HT-29细胞中NLRP3、Caspase 1和IL-1βmRNA相对表达水平均低于740Y-P 30μmol/L单独处理(P<0.05)，但高于DHA 100μmol/L单独处理(P<0.05或P<0.01)(图8)。

3、讨论

DHA是ω-3 PUFAs的一种，对结肠癌细胞、多种肠癌模型小鼠的肿瘤形成均具有抑制或拮抗作用，具体机制仍需探索[6-7]。本研究选用人结肠癌细胞系HT-29，发现DHA抑制HT-29细胞增殖且呈浓度依赖性，进一研究发现DHA抑制细胞中PI3K、Akt和m TOR的磷酸化水平和NLRP3、Caspase 1和IL-1βmRNA表达，740Y-P作用后削弱DHA抑制HT-29细胞的增殖及上述信号通路的分子表达。本研究有助于深入了解DHA抑制人结肠癌细胞作用及机制，为防治肿瘤提供理论依据。

图5 DHA对HT-29细胞中NLRP3,Caspase 1and IL-1βmRNA表达的影响

图6 740Y-P和/或DHA对结肠癌HT-29细胞增殖的影响

图7 740Y-P和/或DHA对PI3K/Akt/m TOR通路蛋白表达的影响

图8 740Y-P和/或DHA对NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路mRNA表达的影响

异常的PI3K信号通路在多种癌中扮演着重要作用，通过调节细胞增殖、凋亡和骨架重组等过程促进肿瘤发生发展[8]。激活的PI3K导致Akt的磷酸化水平升高，继而激活其下游靶蛋白m TOR，磷酸化的m TOR参与调控增殖相关蛋白的合成，从而影响细胞增殖[9]。研究表明，多种植物化学物靶向作用PI3K/AKT/m TOR信号通路可抑制多种结直肠癌细胞株的增殖[10]。多项体外研究表明DHA影响多种人结直肠癌细胞系包括LS174T、Wi Dr、COLO 205和HCT 116的细胞增殖，且使用的DHA作用浓度为20～150μmol/L[2]，而PI3K/Akt/m TOR通路在DHA抑制HT-29细胞增殖的研究中报道较少。有证据显示，DHA可通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导非小细胞肺癌细胞死亡[11]。本研究发现25～100μmol/L DHA抑制HT-29细胞增殖且呈剂量依赖性，其作用机制可能与拮抗PI3K/Akt/m TOR信号通路有关。

NLRP3炎性小体是一种胞质多蛋白复合物，可激活Caspase 1和促进IL-1β释放。NLRP3炎性小体的异常激活与各种炎性疾病的发病机制有关[12]。既往动物实验结果显示内源性ω-3 PUFAs拮抗肠肿瘤形成，其作用与抑制NLRP3/IL-1β表达有关[13]。此外，DHA可抑制5-氟尿嘧啶诱导髓源性抑制细胞MDSC中NLRP3的活化[14]。结直肠组织中NLRP3高表达，体内体外实验证实敲低NLPR3表达的肠癌细胞增殖和迁移受到抑制[4]。因此，本研究中DHA抑制HT-29细胞增殖另一个可能机制是NLRP3炎性小体活化受到抑制。

有限证据表明，PI3K/Akt/m TOR信号通路与NLRP3炎性小体活化可能存在调控关系。选择性5-HT(1A)拮抗PI3K/Akt/m TOR通路可降低NLRP3的表达，降低IL-1β释放，从而改善谵妄症状[15]，另外巨噬细胞中NLRP3炎性小体活化部分依赖于PI3K/Akt通路[5]。PI3K激动剂740Y-P和DHA联合作用后，PI3K/Akt/m TOR通路和NLRP3相关分子表达水平均一致上升，同时削弱了DHA抑制细胞增殖。

综上所述，HT-29细胞增殖受DHA抑制，机制可能与其PI3K/Akt/m TOR和NLRP3/Caspase 1/IL-1β信号通路受阻有关。然而，PI3K/Akt/m TOR和NLRP3炎性小体之间调控关系需要更多实验数据支持。

参考文献:

[1]冯思,张理,谢威,等.ω-3PUFAs在调节结直肠癌发生发展中的研究进展[J].中南大学学报(医学版),2019,44:588-595.

[6]何可,许庆文.n-3多不饱和脂肪酸及结直肠癌模型建立的研究现状[J].海南医学,2013,24:272-274.

基金资助:浙江省医药卫生科技计划项目(2022KY1329);金华市科技计划项目社会发展类重点项目(2020-3-034);金华市科技计划项目公益类项目(2021-4-120);

文章来源:姚安军,陈凌子,金惠仙.二十二碳六烯酸抑制人结肠癌细胞系HT-29增殖[J].基础医学与临床,2024,44(08):1107-1112.