口腔鳞状细胞癌简称口腔鳞癌，占口腔颌面部恶性肿瘤的80%[1]，其较高的发病率严重威胁人类生命健康。口腔鳞癌常发生淋巴结转移和远处转移，多为局部复发，因此治疗效果不佳[2]。探讨口腔鳞癌发生、发展的分子机制并寻找治疗靶点是当前口腔医生的重要任务。长链非编码RNA(lncRNA）是一类小分子单链非编码RNA，其可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)与微小RNA(miRNA）相互作用调控miRNA靶基因的表达，与肿瘤发生、发展密切相关[3]。生长停滞特异性蛋白6-反义RNA1(DLX6-AS1）是近年来新发现的一种lncRNA，其在非小细胞肺癌、宫颈癌、结直肠癌等肿瘤细胞中表达增高，降低其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，是肿瘤治疗的潜在靶点[4,5,6]。但DLX6-AS1在口腔鳞癌中的表达及其对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭的影响，目前还未知。生物信息学软件预测显示，miR-15b可能是DLX6-AS1的靶基因，DLX6-AS1可能作为miR-15b的内源性RNA调控miR-15b靶基因的表达。有报道称，mi R-15b在口腔鳞癌组织中表达降低，过表达mi R-15b可抑制口腔鳞癌细胞Cal27增殖，并诱导细胞凋亡，在口腔鳞癌中发挥抑癌基因作用[7]。生物信息学软件预测显示，磷脂酶D1(PLD1）是miR-15b的靶基因。磷脂酶可将磷脂酰胆碱水解生成磷脂酸和胆碱，影响细胞的增殖、迁移和侵袭等生理功能[8]。研究显示，PLD1可促进胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤的发生和发展[9,10,11]，但其在口腔鳞癌中的作用还未知。本研究以miR-15b/PLD1轴为切入点，深入探讨DLX6-AS1对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为该肿瘤复发、转移分子机制的阐明及治疗靶点的选择提供一定实验依据。

1、材料和方法

1.1一般资料

收集2016年12月—2018年5月于本院确诊并进行手术治疗的38例口腔鳞癌患者的癌组织和对应的癌旁组织，液氮保存，其中癌旁组织距离癌组织边缘>3 cm，病理检测未发现癌细胞。38例患者中男性25例，女性13例，年龄47～72岁，平均年龄（65.29±5.78）岁。TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期8例；淋巴结转移16例，淋巴结未转移22例。排除标准：(1)术前行放、化疗等治疗的患者；(2)心脏、肾等重要器官功能不全者；(3)临床资料不完整的病例；(4)患有免疫系统疾病者。本研究经医院伦理委员会批准同意，患者或其家属自愿签署知情同意书。

1.2细胞和实验试剂

口腔鳞癌细胞HSC3（中国科学院上海细胞库），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640培养基和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），四甲基噻唑蓝（MTT）和胰蛋白酶（美国Sigma公司），LipofectamineTM2000试剂盒和TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒和PCR试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（昆明擎科生物科技有限公司），兔抗人p21、MMP-2、E-cadherin及PLD1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），双荧光素酶活性检测试剂盒（美国Promega公司），DLX6-AS1小干扰RNA、乱序无意义阴性序列、miR-15b模拟物、miR-15b抑制剂及阴性序列、PLD1过表达载体及荧光素酶报告载体（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1 HSC3细胞培养

复苏HSC3细胞，将其培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，并置于37℃、5%CO2、97%湿度的培养箱中培养。显微镜下观察细胞生长情况，及时更换新鲜培养基。当培养瓶底部的细胞融合至80%左右时，0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

1.3.2细胞分组和转染

调整对数增殖期HSC3细胞浓度为2.5×104个/mL，以每孔2.5 mL的量接种于6孔板中。待细胞融合至60%时，参照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书，分别转染DLX6-AS1小干扰RNA(si-DLX6-AS1组）、乱序无意义阴性序列（si-NC组）、DLX6-AS1过表达载体（pcDNA3.1-DLX6-AS1组）、空载体（pcDNA3.1组）、miR-15b模拟物（miR-15b组）、模拟物对照（miR-NC组）、mi R-15b抑制剂（anti-miR-15b组）、抑制剂对照（antimiR-NC组），共转染DLX6-AS1小干扰RNA与miR-15b抑制剂（si-DLX6-AS1+anti-miR-15b组）、DLX6-AS1小干扰RNA与抑制剂阴性对照（siDLX6-AS1+anti-miR-NC组）、DLX6-AS1小干扰RNA与PLD1过表达载体（si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1组）、DLX6-AS1小干扰RNA与空载体（siDLX6-AS1+pcDNA3.1组）至HSC3细胞。转染24 h后，更换新鲜培养基。继续培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.3.3 RT-q PCR检测DLX6-AS1、miR-15b和PLD1m RNA表达水平

应用TRIzol试剂提取口腔鳞癌组织或细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度和纯度后，参照逆转录试剂盒说明书将其合成为cDNA。然后以cDNA为模板，进行扩增。DLX6-AS1上游引物：5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游引物：5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′；mi R-15b上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCA-CATCAT-3′，下游引物：5′-CACAGCTCGTAGAACAG GAGG-3′；PLD1上游引物：5′-GAGCCACGGGTAAA TACCTCT-3′，下游引物：5′-CCGCGTGTCCAGATT TTCTATG-3′；GAPDH上游引物：5′-GTCACCTTC-ACCGTTCCAGTTTT-3′，下游引物：5′-CTTAGTTG-CGTTACACCCTTTCTT-3′；U6上游引物：5′-CTCG-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR扩增条件：95℃5 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s，共35个循环。DLX6-AS1和PLD1以GAPDH为内参，miR-15b以U6为内参，采用2-△△Ct法计算DLX6-AS1、mi R-15b和PLD1 mRNA的相对表达水平。

1.3.4 MTT法检测HSC3细胞增殖

调整各组转染后的HSC3细胞浓度为2.5×104个/mL，以每孔200μL的量接种于96孔板中，每组设置3个复孔。培养48 h后，加入20μL的MTT(5 g/L），继续孵育4 h。取出培养板，将培养基吸弃后每孔加入150μL的二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度值。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。实验重复3次，取平均值。

1.3.5 Transwell检测HSC3细胞迁移和侵袭

用不含FBS的RPMI 1640培养基调整各组转染后的HSC3细胞浓度为5×104个/mL。迁移实验中，在Transwell上室中直接加入100μL细胞悬液，在下室中加入500μL含FBS的RPMI 1640培养基。侵袭实验中，先在Transwell上室铺设Matrigel基质胶，然后加入100μL细胞悬液，下室加入500μL含FBS的RPMI 1640培养基。培养48 h后，吸弃培养基，取出上室。经4%多聚甲醛固定30 min,0.4%结晶紫染色15 min，棉签擦去未穿膜细胞，倒置显微镜观察，随机选取5个视野，对穿膜细胞进行计数。

1.3.6 Western Blot检测HSC3细胞中p21、MMP-2、E-cadherin和PLD1蛋白表达

各组转染后的细胞培养48 h后，收集细胞。加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上充分裂解30 min，提取细胞中总蛋白。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。取适量蛋白溶液，100℃煮沸5 min，变性后，以每泳道30μg上样量行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的蛋白湿转至聚偏乙烯二氟膜，并于5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h。分别加入p21（稀释度1∶800）、MMP-2（稀释度1∶1 000）、E-cadherin（稀释度1∶600）和PLD1（稀释度1∶800）抗体，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1∶200),37℃下孵育1 h。滴加增强化学发光（enhanced chemiluminescence,ECL）显影液，避光显影后，凝胶成像系统曝光拍照。

1.3.7双荧光素酶报告基因实验

生物信息学软件预测显示，miR-15b与DLX6-AS1和核苷酸序列存在连续结合位点，PLD1的3′非翻译区（3′untranslated region,3′UTR）存在与miR-15b结合的核苷酸序列。PCR分别扩增含miR-15b结合位点的DLX6-AS1序列及PLD1的3′UTR序列，并通过基因定点突变技术将结合位点突变，分别构建DLX6-AS1野生型（WT-DLX6-AS1）、突变型（MUT-DLX6-AS1）和PLD1野生型（WT-PLD1）、突变型（MUT-PLD1）荧光素酶载体。分别将荧光素酶载体与miR-15b模拟物或阴性对照共转染至HSC3细胞。转染24 h后，收集各组细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测各组的荧光素酶活性。

1.4统计学分析

SPSS 22.0软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差表示。2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1口腔鳞癌组织中DLX6-AS1、miR-15b和PLD1的表达水平

与癌旁组织比较，口腔鳞癌组织中DLX6-AS1和PLD1 mRNA表达水平升高（P<0.001),miR-15b表达水平降低（P<0.001）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的口腔鳞癌组织中的DLX6-AS1表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期口腔鳞癌组织（P<0.001），而miR-15b的表达水平低于Ⅰ～Ⅱ期口腔鳞癌组织（P<0.001）。发生淋巴结转移的患者口腔鳞癌组织中的DLX6-AS1表达水平高于未发生淋巴结转移患者的口腔鳞癌组织（P<0.001），而miR-15b表达水平低于未发生淋巴结转移的患者口腔鳞癌组织（P<0.001）。详见表1、图1。

2.2抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞活性、迁移和侵袭的影响

si-DLX6-AS1组HSC3细胞DLX6-AS1表达水平低于si-NC组（P<0.001），表明DLX6-AS1小干扰RNA转染成功，HSC3细胞中DLX6-AS1表达受到抑制。与si-NC组比较，si-DLX6-AS1组HSC3细胞存活率、迁移和侵袭数及MMP-2蛋白水平降低（P<0.001),p21和E-cadherin蛋白水平升高（P<0.001）。详见图2。

2.3 DLX6-AS1靶向负调控miR-15b

生物信息学软件预测显示，DLX6-AS1与miR-15b的核苷酸序列存在结合位点。双荧光素酶活性检测显示，miR-15b模拟物可降低WT-DLX6-AS1载体的荧光素酶活性（P<0.001），对MUT-DLX6-AS1载体的荧光素酶活性无显著影响（P>0.05）。pcDNA3.1-DLX6-AS1组miR-15b表达水平低于pcDNA3.1组（P<0.001),si-DLX6-AS1组miR-15b表达水平高于si-NC组（P<0.001）。详见图3。

表1 DLX6-AS1、miR-15b与临床分期及转移之间的关系

图1口腔鳞癌组织中DLX6-AS1、miR-15b和PLD1 mRNA的表达水平

2.4抑制miR-15b表达降低抑制DLX6-AS1对HSC3细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用

与si-DLX6-AS1+anti-miR-NC组比较，si-DLX6-AS1+anti-miR-15b组HSC3细胞存活率、迁移和侵袭数及MMP-2蛋白表达水平升高（P<0.001),mi R-15b及p21、E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.001）。详见图4。

2.5过表达PLD1降低抑制DLX6-AS1对HSC3细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用

与si-DLX6-AS1+pcDNA3.1组比较，si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1组HSC3细胞存活率、迁移和侵袭数及PLD1、MMP-2蛋白表达水平升高（P<0.001),p21和E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.001）。详见图5。

2.6 miR-15b靶向负调控PLD1表达

生物信息学软件预测显示，PLD1的3′UTR与mi R-15b的核苷酸序列存在结合位点。双荧光素酶活性检测显示，miR-15b模拟物可降低WT-PLD1载体的荧光素酶活性（P<0.001），对MUT-PLD1载体的荧光素酶活性无显著影响（P>0.05）。miR-15b组PLD1的mRNA和蛋白水平低于miR-NC组（P<0.001),anti-miR-15b组PLD1的mRNA和蛋白水平高于anti-miR-NC组（P<0.001）。详见图6。

3、讨论

近年来，lncRNA在肿瘤中的作用受到广泛关注。DLX6-AS1是一种新型lncRNA。Fang等[12]的研究结果显示，膀胱癌组织中DXL6-AS1表达上调，其高表达通过介导miR-223基因沉默而上调HSP90B1蛋白的表达，增强膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力，促进膀胱癌发展。Liang等[13]的研究显示，DLX6-AS1在胃癌组织和细胞系中表达上调，其高表达与肿瘤T3、T4期的侵袭、远处转移及预后不良有关。DLX6-AS1通过与miR-204-5p结合并上调蛋白表达，促进了胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，是潜在的胃癌预后生物标志物和治疗靶标。目前，DLX6-AS1对口腔鳞癌复发转移的影响还未知。

图2抑制DLX6-AS1对HSC3细胞的细胞活性、迁移和侵袭及p21、E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响

图3 DLX6-AS1靶向调控miR-15b

图4抑制mi R-15b表达降低抑制DLX6-AS1对HSC3细胞的细胞活性、迁移、侵袭及p21、E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响

图5过表达PLD1能减弱抑制DLX6-AS1对HSC3细胞的细胞活性、迁移、侵袭及p21、E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响

图6 Mi R-15b靶向调控PLD1

本研究显示，口腔鳞癌组织中DLX6-AS1表达水平升高，且其表达与患者TNM分期及淋巴结转移情况密切相关，提示DLX6-AS1可能参与口腔鳞癌的发生与发展。转染DLX6-AS1小干扰RNA至口腔鳞癌细胞HSC3后的结果显示，抑制DLX6-AS1表达后，HSC3的细胞存活率及迁移和侵袭的细胞数降低，提示抑制DLX6-AS1表达可抑制HSC3细胞增殖、迁移和侵袭，是降低口腔鳞癌复发和转移的潜在分子靶点。p21是肿瘤抑制因子，参与细胞周期的调控，其表达增加可抑制肿瘤细胞增殖[14]。MMP-2可降解细胞外基质和基底膜，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[15]。E-cadherin是黏附因子，其表达降低或缺失能使细胞获得侵袭性表型[16]。本研究显示，抑制DLX6-AS1表达后，HSC3细胞中MMP-2蛋白表达降低，而p21和E-cadherin蛋白表达升高，提示抑制DLX6-AS1表达通过下调MMP-2蛋白表达和上调p21、E-cadherin蛋白表达而抑制HSC3细胞的增殖、迁移和侵袭。

生物信息学软件预测显示，miR-15b可能是DLX6-AS1的靶基因。本研究通过双荧光素酶活性报告实验证实了DLX6-AS1可与miR-15b的核苷酸序列靶向结合。此外，上调HSC3细胞中DLX6-AS1表达后，miR-15b表达降低，而下调DLX6-AS1表达后，miR-15b表达升高，提示DLX6-AS1在HSC3细胞中靶向负调控miR-15b。本研究还显示，mi R-15b在口腔鳞癌组织中表达降低，与相关研究报道结果一致[7]。抑制mi R-15b表达降低了抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响，提示DLX6-AS1通过靶向上调miR-15b表达发挥抗口腔鳞癌作用。

为了进一步探究DLX6-AS1靶向调控mi R-15b表达抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制，本研究应用生物信息学软件预测，结果显示PLD1是miR-15b的靶基因。PLD1参与调控细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为。如Kang等[17]的研究显示，结直肠癌细胞中PLD1表达升高，抑制PLD1表达，通过抑制Wnt/β-catenin和PI3K信号通路的激活降低结直肠癌细胞的增殖能力，是结直肠癌的潜在治疗靶点。目前，还未见PLD1影响口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的相关报道。本研究显示，口腔鳞癌组织中PLD1 mRNA表达水平升高，提示其在该肿瘤中也发挥促癌基因作用。本研究还显示，mi R-15b靶向负调控PLD1，过表达PLD1降低了抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响，提示DLX6-AS1作为miR-15b的内源性RNA与miR-15b相互作用，通过下调PLD1表达抑制口腔鳞癌复发和转移。然而，DLX6-AS1下游靶miRNA及miR-15b下游靶mRNA众多，进一步研究DLX6-AS1下游miRNA/mRNA通路是下一步的重点。

综上所述，口腔鳞癌组织中DLX6-AS1呈高表达，抑制DLX6-AS1表达可降低口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其可能通过与miR-15b相互作用进而下调PLD1表达发挥作用，为口腔鳞癌复发、转移分子机制的阐明及治疗靶点的选择提供了新思路。

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