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牙釉基质衍生物促进人工根面牙本质龋的再矿化

2024-08-30 140 上传者：管理员

摘要：目的探讨牙釉基质衍生物(enamel matrix derivative, EMD)对人工根面牙本质龋再矿化作用的影响。方法将牛牙根面牙本质样本放置在脱矿溶液中，形成人工龋损样本，采用简单随机抽样法分为EMD组(30 g/L EMD,实验组)、氟化钠(sodium fluoride, NaF)组(1 g/L NaF,阳性对照组)和去离子水(distilled and deionised water, DDW)组(阴性对照组),进行pH循环处理8 d,每天6次。使用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)及偏振光显微镜(polarized light microscopy, PLM)观察各组处理前后龋损形态学的变化情况，并使用横断显微照相技术(transverse microradiography, TMR)检测处理前后矿物质丢失量、龋损深度和矿物含量的变化情况。结果 pH循环处理后，SEM的表面形态学图像和PLM的垂直形态学图像均显示，EMD组和NaF组人工根面牙本质龋的矿物质沉积增加，而DDW组无矿物质沉积。同时，TMR结果显示，与DDW组相比，EMD组矿物丢失较低，龋损深度较浅，矿物含量较高(P<0.05)。结论釉基质衍生物能促进根面牙本质龋的再矿化，具有成为一种有效的根面无创防龋制剂的潜力。

关键词：
CPP-ACP
再矿化
根面牙本质
根面龋
牙釉基质衍生物
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根面龋是中老年人群中常见的口腔疾病之一，严重影响患者的口腔和全身健康[1]。由于牙根部牙骨质非常薄(20～50 μm)或先天缺失、细菌等多因素的作用，使根面龋容易发展为根面牙本质龋。牙本质含有20%的有机基质(主要是胶原蛋白),远高于牙釉质。当牙本质龋形成时，胶原纤维很容易暴露和降解，导致牙本质龋迅速进展。目前临床上常用的再矿化治疗方式，如氟化物[2]、酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体(casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate, CPP-ACP)[3-4]等，均存在一定的缺陷。考虑到牙本质有机基质的破坏过程是脱矿的结果，寻找一种基于保护牙本质基质初始降解的新策略，来改善根面牙本质龋的治疗效果，是必要和有意义的[5]。

在牙胚发育过程中，上皮根鞘分泌一组蛋白质，即牙釉质基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs),主要由釉原蛋白和非釉原蛋白组成。1975年，SCHONFELD[6]首次证明EMPs可以在牙根形成过程中促进无细胞牙骨质的形成，随后的研究也充分证明了EMPs在调节牙釉质生物矿化中起着至关重要的作用[7-8]。釉基质衍生物(enamel matrix derivative, EMD)是一种从6个月的猪牙胚中提取出来的疏水性EMPs, 含有约95%的釉原蛋白[9]。据报道，釉原蛋白能参与牙齿的形成，并分泌一些促进矿化的生长因子，如转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)和胰岛素样生长因子[10]。 Emdogain(EMDgel)则是由EMD溶解在海藻酸丙二醇载体(propylene glycol alginate carrier, PGA)中形成的一种已经商品化的凝胶类结合物，基于EMD的生物学效应，以及凝胶制剂良好的黏附性能等优势，目前已经应用于口腔多个领域，如刺激牙周组织再生[11]、增加种植体的骨结合[12],以及进行活髓保存治疗等[13]。

目前，关于EMD与牙本质龋的研究较少[14],尚缺乏在体外pH循环条件下的探索。因此，本实验探索了EMD是否能在体外pH循环条件下促进根部牙本质龋的再矿化。

1、材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

醋酸、KH2PO4、KCL(分析纯)为成都科龙化工试剂厂产品，聚甲基丙烯酸甲酯、麝香草酚、戊二醛、KH2PO2购自上海阿拉丁化学有限公司，CaCl2·2H2O(分析纯)为天津塘沽邓中化工厂产品，NaF(分析纯)为西安化学试剂厂产品，HEPES购自美国ANRESCO公司，去离子水由Millipore纯化系统提供，指甲油由美国美宝莲公司生产。

主要仪器：硬组织切割机(Struers Minitom, 丹麦)、抛光机(Struers Lobopol, 丹麦)、碳化硅砂纸(Struers, 丹麦)、磁力搅拌器(85-2型，上海司乐仪器有限公司)、恒温摇床(station SA 500,英国)、超声波清洗仪(KQ -50B型，昆山市超声仪器有限公司)、pH测量仪(710A,美国ORION公司)、体视显微镜(Nikon SMZ-1500, 日本)、偏振光显微镜(Nikon ECLIPSE ME600L,日本)、扫描电子显微镜(Hitachi S-5000型，日本)、显微放射照相仪(飞利浦，荷兰)及显微放射照相标本载体(Inspektor Research Systems BV,荷兰)。

1.2 EMD的获取

Emdogain(Emdogain-Straumann, Biora, Sweden)是由EMD溶解在PGA中形成的商品化的凝胶制剂，1支注射器内含0.7 mL凝胶，其中EMD的浓度为30 g/L。本研究在pH循环过程中，先在根部牙本质龋上方注射1滴EMDgel凝胶，然后将其涂薄，覆盖在病损表面[15]。

1.3 样本制备

本研究实验样本为购自成都市百瑞农业有限公司的4岁牛门牙。60颗牙齿从颌骨中取出后，用手术刀从根部小心地清除残留的有机污染物，处理后的牛牙样本被储存在0.05%麝香草酚溶液中，4 ℃保存备用。从中选取根面完好、无裂缝或氟斑的牛门牙55颗，用硬组织切割机进行冠根分离，取釉牙骨质界下方牙根，制备5 mm×5 mm×5 mm的牙根组织块，置超声波清洗仪中清洗30 min, 体视显微镜下选取无龋、无裂痕、无缺隙的样本100例，置于去离子水中冲洗，自然干燥后，所有样本都表面朝下嵌入聚甲基丙烯酸甲酯中包埋，待材料凝固后，牙骨质面用碳化硅砂纸在流水下按800粒度到5 000粒度的顺序依次磨平，使用体视显微镜观察样本表层牙骨质被去除后[16],用15 μm的金刚石研磨膏手工抛光，在表面涂上2层耐酸指甲油，保留约3 mm×4 mm的开窗区。制备的样本如图1。

图1 牛牙根部牙本质样本

1.4 病损的形成

将所有样本置于密闭玻璃容器内，加入脱矿液(2.2 mmol/L CaCl2·2H2O,2.2 mmol/L KH2PO2,50 mmol/L醋酸；pH=4.6),置于37 ℃的恒温摇床中，使用磁力搅拌器1.119×g离心4 d, 形成根面牙本质龋[17]。将2层耐酸指甲油涂在标本开窗区的一半，只露出3 mm×2 mm的表面。

1.5 pH循环实验

通过简单随机抽样的方法，将根面牙本质龋块按pH循环中处理试剂不同分为：EMD组(30 g/L EMD,实验组)、NaF组(1 g/L NaF,阳性对照组)和DDW组(阴性对照组),每组20个样本。实验溶液/凝胶处理10 min, 酸性缓冲液 (50 mmol/L醋酸，2.25 mmol/L CaCl2·2H2O,1.35 mmol/L KH2PO4,130 mmol/L KCl; pH=5.0)处理30 min, 中性缓冲液(20 mmol/L HEPES,2.25 mmol/L CaCl2·2H2O,1.35 mmol/L KH2PO4,130 mmol/L KCl; pH=7.0)处理10 min。每天重复循环6次，共8 d。

1.6 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察

pH循环后，为了检查样本表面的形态变化，各组随机抽取5个样本，放入2.5%戊二醛液内，4 ℃下固定24 h。干燥，镀金，分别在工作电压为20 kV的条件下，用扫描电子显微镜放大2 000倍和10 000倍，观察pH循环后样本表面形态。

1.7 偏振光显微镜(polarized light microscopy, PLM)观察

pH循环后，各组随机抽取5个样本，于硬组织切割机上垂直于开窗区表面切片，每张切片包括pH循环前后2部分组织，切片厚约300 μm, 然后在抛光机流水下磨制成约100 μm厚的薄片，再经水浸渍后用偏振光显微镜观察，数码图像由系统专用软件(Nikon ACT-1 for L-1,Nikon, 日本)获取。

1.8 横断显微照相(transverse microradiography, TMR)测量

pH循环后，各组随机抽取6个样本，将样本固定在显微放射照相标本载体上，然后通过单色CuK的X射线源，在20 kV和20 mA的条件下，曝光30 s, 显微放射照相仪检测，通过显微放射照相结果分析软件2006(Inspektor研究系统，阿姆斯特丹，荷兰)分析矿物质丢失、龋损深度和选定深度的矿物质含量。该软件可以获得从牙本质表面到矿物质含量达到正常牙本质87%的各层矿物质丢失量和龋损深度数据。

1.9 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，各组内pH循环前后的矿物质丢失量、龋损深度以及表层和病损体部的矿物质含量采用配对t检验，各组间pH循环前以及pH循环后的矿物质丢失量、龋损深度以及表层和病损体部的矿物质含量采用单因素方差分析和两两比较，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 扫描电子显微镜观察

扫描电子显微镜下观察到，pH循环后，EMD组样本表面有一层分布较为均匀的矿物质沉积，牙本质小管部分封闭(图2A、B);NaF组样本表面也有一层明显的矿物质沉积，且较EMD组多，牙本质小管基本完全封闭(图2C、D);DDW组样本管周和管间牙本质均发生了不同程度的脱矿，表面无再矿化层形成(图2E、F)。这些结果表明，除DDW组外，EMD和NaF组的样本均会在表面形成矿物质沉积。

2.2 偏振光显微镜观察

如图3所示，在pH循环前，所有样本未出现明显的矿化表层，说明表面未发生明显再矿化。pH循环后，EMD组(图3A)和NaF组(图3B)牙本质表面沉积物清晰可见，而DDW组样本再矿化后无明显表层形成(图3C)。EMD组和DDW组龋损深度均增加，但EMD组深度与DDW组相比加深得较少，说明EMD可能具有抑制牙本质脱矿的作用。

图2 pH循环后各组扫描电子显微镜下表面矿物质沉积情况

A、B:EMD组pH循环处理后根部牙本质表面放大2 000、10 000倍扫描电镜图箭头：示部分封闭的牙本质小管；C、D:NaF组pH循环后根部牙本质表面放大2 000、10 000倍扫描电镜图箭头：示基本完全封闭的牙本质小管；E、F:DDW组pH循环后根部牙本质表面放大2 000、10 000倍扫描电镜图箭头：示开放的牙本质小管

图3 pH循环前后各组偏振光显微镜下矿化表层及龋损深度变化情况

2.3 横断显微照相测量

表1显示了各组pH循环前后矿物质丢失、龋损深度以及表层和病损体部矿物质含量的变化情况。结果显示，pH循环前，各组基线数据比较差异无统计意义；pH循环后，NaF组与其他2组相比，矿物质丢失明显减少(P<0.05),病损明显变浅(P<0.05),矿物质沉积明显增多(P<0.05),DDW组与其他2组相比，在pH循环后表层和病损体部矿物质含量最低(P<0.05)。值得关注的是，与DDW组相比，pH循环后的EMD组矿物质丢失明显减少，病损深度更浅，矿物质含量更高(P<0.05)。结果表明，EMD对牙根部牙本质龋的再矿化有一定的促进作用。

pH循环后TMR图像结果(图4A～C)显示，各组存在不同的表层(不透光组织，即图中标注为S的区域)和病损体部(透光组织，即图中标注为L的区域)。NaF组和EMD组表面的不透光射线带明显，NaF组比EMD组更厚。而与DDW组相比，EMD组的条带则更厚，实际上，这个不透光的射线带在DDW组中几乎看不出来。EMD组和DDW组的放射透光区增加，后者在外观上更深。其中NaF组的表层最宽，病损体部最浅。pH循环后各组矿物体积百分比的差异见图4D～F。与DDW组相比，EMD组在表层显示出更大的矿物体积百分比。在3组中，NaF组在表层含有最多的矿物体积百分比。

表1 pH循环前后各组矿物质丢失量、龋损深度及表层和病损体部矿物质含量变化

图4 pH循环后各组表层矿物质沉积、病损体部深度以矿物体积百分比情况

3、讨论

EMD是从发育中的猪牙胚内提取的EMPs的衍生物，随着EMDgel的生产和使用，其逐渐被牙医作为一种新型的治疗选择。釉原蛋白是EMPs中含量最高(>95%)的一种成分，也是其主要的活性成分，在晶体形成和矿化中发挥着重要的作用[18-19]。牙本质中含有20%的有机基质(主要是胶原蛋白),其含量远高于牙釉质，且Ⅰ型胶原纤维占了牙本质有机基质的90%,当牙本质龋形成时，胶原纤维很容易暴露和降解，导致牙本质龋迅速进展，胶原纤维的存在对牙本质龋残留晶体的再生至关重要[20],EMPs则可以通过与Ⅰ型胶原纤维结合，并吸附在羟基磷灰石和胶原上形成多分子层，从而稳定暴露的胶原纤维，促进龋损的逆转[21]。由于EMPs的生物学功能特点以及牙本质龋的发生发展过程，EMD作为一种有机基质，在抑制牙本质龋方面可能具有一定的优势。基于此，本实验研究了EMD是否可能成为预防或治疗根面牙本质龋的一种有前景的再矿化药物。

由于伦理约束、个体差异以及牙根体积的限制，单纯使用人牙很难满足实验需要。EDMUNDS等[22]曾指出，牛牙的人工龋损与人牙的病变相似，近年，LIPPERT等[23]的研究也表明，牛牙牙本质可以被认为是人牙牙本质合适的替代品，尽管两者之间仍然存在一些差异。因此，本实验选择了牛牙本质代替人牙本质。为了形成人工根面牙本质龋，本实验按照XIE等[17]的方法制备了标本。pH循环过程则模拟了体内自然龋损的形成过程，包括pH值和矿物离子饱和度的动态变化[24]。氟化物作为一种有效的防龋制剂，得到了广泛的应用，其防龋效果肯定。因此，本实验选用了NaF作为阳性对照组来评价EMD的再矿化作用。然而，氟化物的进一步应用受到氟中毒或耐氟菌株等因素的限制，新的防龋方法需要不断探索。此外，本实验也设立了DDW阴性对照组，以评价EMD的再矿化的作用。

本实验对样本进行了SEM和PLM的观察以及TMR分析。TMR通常被认为是检测牙体硬组织脱矿和再矿化的金标准[25],SEM和PLM则从不同维度的微观层面直观地验证实验结果。TMR结果显示，与DDW组相比，pH循环后EMD组的矿物质丢失量减少，龋损深度变浅，表层和病损体部矿物质含量变高；NaF组的所有测量结果展示出了最佳的再矿化效果。结果表明，EMD在体外可以促进根面牙本质龋的再矿化。但这与前期已有的关于EMD与根面牙本质龋之间的研究[14]结论并不一致。分析原因，本实验是通过EMD存在于凝胶中的形式多次作用于人工根面龋，使EMD呈现出较好的黏附力和作用时间，因此展现出了对根面牙本质龋良好的再矿化作用。SEM、PLM和TMR的图像结果则进一步验证了TMR测量数据所得的实验结论。当然，EMD对牙本质龋的作用效果还有待于进一步通过动物及临床试验验证。

本研究证实EMD在体外促进根面牙本质龋再矿化的潜力，但目前尚不清楚哪些成分可以被纯化或合成，以达到治疗或预防根面牙本质龋的最佳效果。因此需要进一步研究基于EMPs结构和功能的合成多肽，以增加牙本质龋的矿物质吸收和矿化。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81271128)~~;

文章来源:陈进,梁静鸥,张凌琳.牙釉基质衍生物促进人工根面牙本质龋的再矿化[J].陆军军医大学学报,2024,46(16):1890-1896.