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牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究

2020-08-20 459 上传者：管理员

摘要：目的:利用Micro CT(micro computed tomography)定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成。方法:选取30只4～5周龄健康C57BL/6J小鼠,随机分为颅骨矢状缝假手术对照组与牵张加力组,每组15只。每组随机分为3小组,每小组5只,分别在牵张7、14、28 d后处死。对颅骨进行Micro CT扫描和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色分析。结果:与同期对照组比较,牵张加力组小鼠矢状缝平均扩大(3.55±0.53) mm(P<0.05),Micro CT和HE染色证明牵张区有新骨形成,形成部位主要位于顶骨边缘。结论:Micro CT可以直观还原小鼠颅骨缝牵张成骨过程并对骨骼参数进行全面定量分析,对于研究骨缝牵张成骨应用前景广阔。

关键词：
临床诊疗
口腔正畸
定量分析
牵张成骨
颅骨缝
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颅骨缝是颅面骨骼重要的活跃生长区,其发育异常常导致颅颌面畸形及颌骨功能紊乱,极大影响患者的美观和身心健康[1]。骨缝牵张成骨术在临床中广泛应用于颅颌面畸形的矫治[2]。颅骨缝改建规律对治疗效果有极大影响[3],至今对颅骨缝牵张后新骨形成与改建机制仍未完全阐明。以往对于骨缝牵张成骨的研究多着眼于组织学表现[4],对于Micro CT分析报导相对较少[5]。本研究运用C57BL/6J小鼠构建颅骨缝牵张模型,利用Micro CT的高分辨率和直观性的优点[6],还原骨缝牵张成骨过程并对骨骼参数进行全面深入的定量分析,同时结合组织学方法对新生骨进行观察,以明确颅骨缝牵张成骨的骨形成过程,对临床寻找合理治疗方法促进颅骨缝生长改建有重要意义,并为进一步深入研究奠定实验基础。

1、材料与方法

1.1主要试剂与仪器

用于制作牵张加力器的直径0.012英寸的澳丝(AJ Wilcock Pty Ltd,澳大利亚);Micro CT(SCANCO,瑞士);石蜡包埋机(Leica,德国);全自动半薄轮转切片机(Leica,德国);组织自动脱水机(Leica,德国);HE染液(碧云天,中国)。

1.2实验动物及分组

选取30只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级4～5周龄健康雄性C57BL/6J小鼠,购自南京医科大学实验动物中心,经检查颅顶饱满无明显畸形,随机分为颅骨矢状缝假手术对照组与牵张加力组,每组15只。每组随机分为3个小组,每小组5只,分别在牵张7、14、28 d后处死。

1.3加力器的设计及制作

本实验运用由直径0.012英寸的澳丝弯制的加力器。每条加力臂压缩2 mm回弹后可产生每侧约20 g的扩展力。

1.4实验方法

1.4.1动物麻醉及加力器安装

所有小鼠均用3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(0.015 mL/100 g体重)。颅顶处备皮,术区消毒,剪开头皮暴露矢状缝,小心去除骨缝周围结缔组织。作矢状缝的垂直平分线,线上距离矢状缝3.5 mm处对称标记两点,用7号针针头小心戳出小孔。加力组加力器两臂间距离11 mm,压缩至距离为7 mm置入小孔,释放加力臂产生扩张力。对照组加力器两臂间距离7 mm,被动插入小孔。安装完毕后缝合头皮并消毒术区(图1)。实验方法已通过南京医科大学动物实验伦理委员会审核。实验伦理编号:IACUC-1803015。

图1小鼠矢状缝牵张模型建立

1.4.2实体标本测量

在牵张7、14和28 d后分别处死各组小鼠并收集其颅骨,在牵张加力器在位的情况下用圆规、直尺测量其两臂间直线距离。

1.4.3影像学观察

牵张7、14和28 d后的小鼠颅骨收集后于4%多聚甲醛中固定12 h,去除加力器后行Micro CT扫描,分辨率为15.6μm。所得数据首先用DataViewer软件进行头位调整,使所有颅骨均为脑组织面朝下,枕骨朝后;使用CT Vox软件进行图像重建;使用CTAn软件,在所有颅骨矢状缝冠状向上以所打两孔连线为基准,分别向前和向后8932.4μm×3128.2μm的矩形各截取5层图像进行骨骼参数分析(图2)。

图2 ROI区域选择及其截面示意图

1.4.4组织学观察

将甲醛固定后的颅骨标本流水冲洗过夜,置于10%乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA)中脱钙2～3周,逐级脱水石蜡包埋,5μm切片,55℃恒温烤片2 h后行染色,显微镜下观察矢状缝组织学变化。

1.4.5统计学分析

所有数据均用x¯±s的形式表示,并使用Graphpad Prism 7.04软件进行统计分析,同一时间点实验组和对照组的比较采用t检验,不同时间点对照组或实验组之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05具有统计学差异。

2、结果

所有实验小鼠均顺利完成颅骨缝牵张手术并且在实验过程中牵张加力器没有脱位。牵张加力组小鼠和同期对照组小鼠矢状缝相比较被显著扩大(P<0.05)。

2.1实体标本观测

牵张加力实验组牵张7 d后,牵张区主要为纤维组织,质地柔软,颜色透明。牵张14 d后,牵张区纤维组织范围减小,新骨组织形成,颜色浑浊,向中央纤维组织区延伸,呈锯齿状交织。牵张区硬度增加。牵张28 d后,纤维组织范围进一步缩小,新骨组织增加,逐渐充填牵张区,牵张区硬度显著增加。牵张7 d后所打两孔间距离和同期对照组相比显著增加(P<0.05)。牵张14和28 d后的实验组两孔间距离和第7天相比没有显著变化(P>0.05)。见表1。

表1实体标本检测所打两孔间距离

2.2 Micro CT观察(图3)

Micro CT显示牵张7d后,矢状缝区域被扩大,呈低密度透射区。和对照组相比,显示骨量的指标如骨体积分数(bone volume/tissue volume,BV/TV)和显示骨矿化程度的指标骨密度(bone mineral density,BMD)显著减少(P<0.001)。骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)增加,提示骨质结构更疏松,见表2。牵张14 d后,矢状缝区域有较多新生骨组织形成,新生成骨带与中央低密度透射区边界模糊,和第7天相比,骨体积分数和骨密度有所增加(P<0.05),骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)增加(P<0.001)。牵张28 d后,较第14天骨密度有所增加(P<0.05),骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)增加,提示骨小梁增粗,但骨小梁数量并没有显著统计学差异。牵张28 d后矢状缝区域骨密度、骨体积分数仍然低于对照组,而骨小梁分离度高于对照组(表2),提示骨骼量和骨空间结构仍未完全恢复正常水平。

图3不同加力时间小鼠矢状缝CT观察结果

图4苏木精-伊红染色

2.3组织学观察

HE染色结果显示,牵张7 d后矢状缝宽度增加,牵张区内有大量成纤维细胞和间充质细胞,在两侧顶骨的边缘有幼稚骨小梁形成,排列方向与牵张力一致。牵张14 d后,牵张区骨小梁显著增多,略有增粗呈编织状,其表面有大量形态饱满的成骨细胞和胞质均一的骨细胞。牵张区中央为间充质细胞和胶原纤维组织,未见软骨形成。牵张28 d后,牵张区骨小梁增粗,钙化增强,可见成熟哈弗氏系统。牵张区中部仍可见纤维结缔组织。见图4。

表2 Micro CT骨骼参数分析

3、讨论

3.1骨缝牵张成骨目前已广泛运用于临床,如上颌骨前牵装置、腭中缝扩大装置等以矫治颅颌面畸形[7]。以前试图通过单纯加快牵张速率或加大牵张力量以加快成骨速率的尝试均失败[8],由此对于牵张成骨具体机制的深入研究具有重要的临床意义。本实验利用0.012英寸的澳丝制作牵张加力器,在实验过程中,30例加力器无一脱落,稳固性良好,并且获得显著的矢状缝扩大效果。但由于其金属材质的特点,在CT扫描的过程中产生伪影,影响图像观察分析,因此本实验采取不同时间点处死小鼠以后采集样本分别分析的方法,因此实验结果无法排除不同个体之间的差异。有文献报道采用可透X线的材料及外固定的方式进行大鼠股骨的牵张加力,避免扫描过程产生的伪影[9]。其方法运用于小鼠颅骨缝牵张扩大的效果有待进一步研究。

3.2以往对于骨缝牵张成骨的研究多着眼于单个时间点,探究外界因素对此时期牵张成骨效果的影响[10]。本实验依据文献,采用连续牵张7、14、28 d 3个时间点[11],分别代表牵张的早期、中期和后期,使用Micro CT扫描小鼠矢状缝的牵张加力模型后进行图像重建并全面深入地分析骨骼参数[12,13],直观地还原了矢状缝牵张成骨的大体过程,并对牵张区域在整个牵张过程中的成骨变化有了更清晰地认识,为后续实验选择时间节点提供了参考价值。在牵张早期矢状缝被扩大后,间隙主要为纤维结缔组织增生以暂时应对机体受到的损伤性外力刺激,在此期间牵张区域骨的数量和结构性能显著下降。牵张中期,结合HE染色结果发现,成骨活性明显增加,新生骨从两侧顶骨的边缘向中央纤维组织区域生长,牵张区域骨量增加,但由于新生骨骨小梁结构较为幼稚,此期骨骼性能仍然欠佳。牵张后期,骨密度增加,骨小梁厚度增加但是数量较牵张中期没有显著变化,提示此期成骨活性降低,但骨骼空间结构性能有了提高[14]。但是牵张28 d后骨骼量、骨密度、骨小梁厚度仍低于对照组,提示28 d时牵张区域的骨量和骨骼性能仍未完全恢复到正常水平,观察时间应向后延长。

参考文献：

[5]郑晓辉,田卫东,龙洁,等.山羊下颌骨牵张成骨术的实验研究[J].四川大学学报(医学版),2005,36(03):386-389.

[6]魏占英,章振林.Micro-CT在骨代谢研究中骨微结构指标的解读及应用价值[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2018,11(2):200-205.

[9]薛静,彭江,汪爱媛,等.活体小动物Micro-CT动态评价大鼠股骨牵张成骨[J].中国矫形外科杂志,2010,18(9):752-758.

[12]赵芮,李汶洋,胡静.乳铁蛋白对牵张成骨促进作用的研究[J].口腔医学研究,2016,32(3):249-252.

王珈璐,张卫兵.牵张力作用下小鼠颅骨缝成骨的定量分析[J].口腔医学研究,2020,36(08):753-756.

基金:国家自然科学基金面上项目(编号:81671019)