组织工程学在口腔种植方面的研究主要集中在种植体周骨再生、相关生长因子和信号通路调控、骨与软组织的种子细胞与支架材料、组织工程技术增强的各种骨增量技术等领域[1]。20世纪70年代人类即发现了血小板的再生潜能，血小板被激活后能够释放大量内含的生长因子，有助于胶原蛋白产生、细胞有丝分裂、血管生长及其他细胞对损伤部位的趋化和细胞分化，在骨缺损的修复及软组织再生过程中均发挥着重要作用[2]。

富血小板纤维蛋白作为第2代血小板浓缩制品，于2000年首次由CHOUKROUN等[3]将自体血离心后获得，其中未添加任何抗凝剂、激化物。富血小板纤维蛋白是一个富含生长因子、细胞因子，并可在一定时间后再吸收的膜释放纤维蛋白基质[4]。生长因子是一类天然生物递质，通过结合特定的细胞表面受体调节细胞增殖、趋化、分化和基质合成等组织再生过程[5]。这些生长因子在不同时间释放，呈天然比例，在成骨细胞的分化、增殖、黏附、矿化过程中相互作用，相辅相成。纤维蛋白是一种桥联分子，使一系列细胞相互作用并提供一个临时基质，细胞可以增殖、组织和履行职能，主要是机体损伤处的炎症反应。纤维蛋白还可以为成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移提供基质，参与血管生成过程，促进组织的愈合[6]。富血小板纤维蛋白中含有白细胞、纤维基质及多种生长因子，而这些物质不仅在骨修复、骨再生过程中起关键作用，在抗炎及促进软组织愈合过程中也至关重要。富血小板纤维蛋白的细胞增殖作用不仅限于成骨细胞，而是多种类型，包括牙周膜细胞、成骨细胞、牙龈成纤维细胞、口腔上皮细胞、骨髓间充质干细胞，脂肪细胞、前角蛋白细胞等[7,8,9]。

医用诱导骨基质(金骨威)，是由猪骨中提取并纯化的骨形态发生蛋白和诱导性骨基质载体复合而成、具有骨诱导活性的生物医用材料，其含有能诱导和促进骨生长的骨形态发生蛋白[10]，可诱导植入部位间充质细胞向成骨细胞方向分化，从而加速骨的生长[11]。此次研究以家兔下颌骨种植体周围骨缺损为实验模型，通过植入医用诱导骨基质与不同比例富血小板纤维蛋白的混合物，探讨二者联合应用对种植体周围骨缺损的成骨效果。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，多个均数比较采用方差分析。

1.2 时间及地点

实验于2014年9月至2015年12月于河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

成年雄性新西兰大耳白兔12只，体质量约3kg，由河北医科大学第二医院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3.2 试剂、仪器

四环素(北京百灵威科技有限公司)，钙黄绿素(Fluka，波兰)，钛螺纹钉(西安中邦钛生物材料有限公司)，医用诱导骨基质(上海骁博科技发展有限公司)，台式离心机(VRera80-2型，中国)，牙片机(KODAK，美国)，硬组织切片机(LeicaSP1600LeicaMicosystemWetzlar，德国)，荧光显微镜(Olympus，日本)，光学显微镜(OlympusBX61，日本)。

1.4 实验方法

12只兔根据随机数字表随机分为术后4,8,12周组，每组4只。

1.4.1 富血小板纤维蛋白制备及医用诱导骨基质准备

兔双耳脱毛备皮，一侧耳中动脉采血5mL×4共20mL，置于无菌真空空白采血管中，3000r/min，离心8min，静置5min后可见采血管内血液分为3层，最上层血浆层，最下层破碎红细胞层，中间胶冻状即为富血小板纤维蛋白。完整取出富血小板纤维蛋白凝胶，放置于干净纱布，轻轻按压形成富血小板纤维蛋白膜，见图1A,B，小剪刀将富血小板纤维蛋白膜剪碎。医用诱导骨基质与生理盐水充分混合浸泡至柔软半透明，无菌纱布吸干多余水分，见图1C。

1.4.2 骨缺损的制备

同一只兔，选择另一侧耳的耳缘静脉给予3%戊巴比妥钠1mL/kg麻醉后，双侧下颌脱毛备皮，2%盐酸利多卡因行局部浸润麻醉，沿右侧下颌骨下缘切开皮肤，皮下组织、肌层直至骨膜，切口长约3cm，暴露术区，用直径为5mm的平台钻于距离下颌骨下缘上2mm处制备直径5mm、深2mm的圆柱形骨缺损区共3个，期间生理盐水降温。3个骨缺损彼此之间间隔为2mm，自近中至远中依次编号为1,2,3；另一侧下颌骨相同操作制备3个骨缺损，自远中向近中编号依次为4,5,6，见图2A。

1.4.3 种植体的置入

裂钻于骨缺损中心处备洞，6个骨缺损区内均置入2.0mm×7.0mm的钛螺纹钉，螺纹钉螺帽顶部平齐正常骨面，见图2B。螺纹钉直立并获得良好的初期稳定性。

1.4.4 不同比例富血小板纤维蛋白及医用骨基质的填入

分别称量骨基质、富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白与骨基质2∶1混合物、1∶1混合物、1∶2混合物，每个骨缺损区填充物总质量均为0.02g。

1-3号骨缺损内分别填入富血小板纤维蛋白与骨基质2∶1混合物、1∶1混合物、1∶2混合物；4号为空白对照，5号填入富血小板纤维蛋白，6号填入骨基质。将称质量后的所有填充物分别填入骨缺损，分层对位缝合骨膜，肌层和皮肤。术后连续3d肌注青霉素钠40IU预防感染。

1.4.5 标本的获取

从术后4,8,12周组中各随机抽取1只实验动物进行荧光标记，于处死前10d，连续3d颈部皮下注射盐酸四环素25mg/kg；处死前3d，连续皮下注射钙黄绿素5mg/kg。

分别于术后4,8,12周时处死各组实验动物，离体下颌骨。行X射线片检查后，标本固定、清洗、脱钙，取出螺纹钉，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色；荧光标记实验标本行硬组织切片及亚甲基蓝染色。

1.5 主要观察指标

(1)动物观察：观察实验动物术后进食水、活动及精神状态等一般情况；(2)大体观察：观察钛螺纹钉有无松动脱落，有无感染，骨缺损区的成骨情况及医用诱导骨基质吸收情况；(3)X射线片检查：对标本进行X射线片检查，根据密度初步判断钛螺纹钉周围及骨缺损区成骨情况；(4)荧光显微镜检查：根据钙黄绿素及四环素不同颜色条带的分布情况来反映骨形成初期、骨改建、骨成熟期的成骨量；(5)苏木精-伊红染色观察：行苏木精-伊红染色后显微镜下观察骨缺损区的骨质、骨量及周围纤维结缔组织情况，以钛螺纹钉上端骨缺损区×100镜下组织为单位计算骨形成率，骨形成率=新形成骨的总面积/观察区域组织总面积×100%;(6)亚甲基蓝酸性品红染色：更清晰地观察成骨细胞及成骨情况。

1.6 统计学分析

所有统计数据采用SPSS13.0统计软件进行处理，采用多个均数比较的方差分析对不同愈合时间各个骨缺损的骨形成率进行比较，P<0.05时为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

12只兔在观察周期内均无感染、无死亡，全部进入结果分析。术后当天无进食，精神差，较少活动；术后第1天开始少量进食，3d后均恢复正常饮食和活动，无感染及死亡。

2.2 大体观察

兔下颌骨原手术切口愈合良好，缝线已脱落，伤口未见红肿，螺纹钉固定良好无松动和脱落，种植体周围未见骨缺损及未吸收的骨基质颗粒，部分螺纹钉表面可见不同程度的骨质覆盖及纤维结缔组织包绕。相同部位种植体表面覆盖的骨质愈合时间越长，骨质越厚。

2.3 X射线片检查结果

各组钛螺钉周围均有不同程度的高密度影，钛螺钉螺帽至螺纹均被不同程度的骨组织包绕，螺纹与螺纹之间亦存在不同程度的骨质长入。随着富血小板纤维蛋白含量升高，螺纹间骨质密度也随之升高。反之，骨质密度相对较低，部分甚至可见原骨缺损边界，螺纹与长入骨质之间存在低密度影，见图3。

2.4 苏木精-伊红染色结果

随着富血小板纤维蛋白含量的升高，网状间质变得致密且范围明显减小，纤维结缔组织越来越少且更加致密，血管数目增多，成骨细胞增多，可见骨小梁。随着愈合时间的延长，骨小梁排列更加规则，呈岛状，继而形成板层状，可见大量骨陷窝。

骨形成率由高到低依次为：富血小板纤维蛋白/骨基质2∶1>富血小板纤维蛋白>富血小板纤维蛋白/骨基质1∶1>富血小板纤维蛋白/骨基质1∶2>骨基质>空白对照，见图4-6。

2.5 骨形成率分析结果

分别对术后4,8,12周组骨形成率进行统计分析，统计结果显示不同时间组各个骨缺损之间骨形成率差异均显著性意义(P<0.05)，且骨形成率由高到低依次为：1号(富血小板纤维蛋白/骨基质为2∶1)>5号(富血小板纤维蛋白)>2号(富血小板纤维蛋白/骨基质为1∶1)>3号(富血小板纤维蛋白/骨基质为1∶2)>6号(骨基质)>4号(空白对照)，见表1。

2.6 荧光标记结果

钙黄绿素是新骨形成处的绿色荧光条带,代表骨代谢与增生旺盛，四环素为土黄色条带位于新生骨的内侧，主要代表骨改建和骨成熟。富血小板纤维蛋白与骨基质2∶1混合的骨缺损区条带最为广泛，富血小板纤维蛋白次之，剩余骨缺区随着富血小板纤维蛋白的减少条带越窄，空白对照组范围最小，见图7-9。

2.7 甲苯胺蓝酸性品红染色结果

黑色为种植体，红色为新生成骨组织。术后4周组可见骨小梁，骨组织与种植体间夹杂较多的纤维组织，未置填充物的骨缺损区仅见少量骨小梁，种植体被大量纤维组织环抱；随着愈合时间的延长，相对应骨缺损区骨组织有所增多，骨小梁增粗并逐渐融合成片状，见图10-12。

2.8 种植体与宿主的生物相容性

所有动物均未发生种植体相关的免疫及排斥反应。

3、讨论

种植体周骨缺损是临床经常遇到的问题，会导致种植体暴露、松动甚至脱落。在各种骨缺损修复材料中，富血小板纤维蛋白一直是近年来关注热点，富血小板纤维蛋白的使用是一种简单、低成本、低资源的技术，可改善愈合期，促进骨组织的再生和成熟，从而缩短种植体的骨结合时间[12]。富血小板纤维蛋白是在离心过程中发生自然而缓慢的聚合，形成较为稳定的三维立体纤维蛋白网络，是生物活性分子的储存库，有助于伤口愈合和骨再生[13,14]。富血小板纤维蛋白不但能缓慢释放生长因子，同时纤维结构可为细胞迁移提供支持[15]，富血小板纤维蛋白中含有大量的生长因子，包括转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子及胰岛素样生长因子Ⅰ等，这些生长因子在7-28d之内缓慢释放，在成骨细胞增殖、骨基质形成和矿化中均发挥着重要作用，对组织愈合、骨和软组织的再生具有调节作用[16,17,18,19]；

此外，富血小板纤维蛋白的纤维蛋白为疏松多孔网状结构，其支持作用无疑是富血小板纤维蛋白发挥治疗潜力的决定性因素[20]；这些特性和优势使富血小板纤维蛋白成为一种很有前途的生物材料，供临床医生和不同领域的口腔颌面外科医生使用。富血小板纤维蛋白最广泛的应用是替代骨移植材料或屏障膜来处理拔牙后的拔牙窝，此外也单独或联合骨移植材料用于上颌窦提升，其除了在硬组织再生中的重要作用外在软组织再生中也有巨大潜能，例如在软组织根面覆盖、牙周组织再生及种植体周软组织再生中的应用。富血小板纤维蛋白在全口牙弓即刻种植、即刻负荷中的应用，可促进伤口愈合及移植物的稳定，得到良好的修复效果。除了口腔领域，富血小板纤维蛋白在面部整形美容中也得到了应用，例如鼻唇沟年轻化、唇部丰满术、联合聚对二氧环己酮线改善面颊及颈部皮肤的下垂等，其容易重塑形成膜，作为基质，加速创面愈合，促进新骨形成，减少移植材料的愈合时间[21]。

但是不可否认的是，富血小板纤维蛋白也存在一定不足，其膜的刚性较差，不足以支撑骨缺损空间，且降解相对较快，临床多与自体骨或骨替代材料联合应用。自体骨被认为是大规模重建手术的金标准，但它们可能不能完全满足缺损部位大小、形状、几何形态的需求。骨组织工程学已经提供了生物相容性材料，这些材料可用作支架或用于操纵骨形成细胞的功能或将新骨引导成所需的形状[22,23,24]。富血小板纤维蛋白与骨移植物混合可促进全骨血管生成、干细胞迁移和成骨分化，有利于骨移植物的整合[25,26]。此次研究应用自体富血小板纤维蛋白凝集物与异体骨替代材料的混合物，用于种植体周骨缺损的修复，观察骨再生的效果。此次研究中骨形成率由高到低依次为富血小板纤维蛋白/骨基质2∶1>富血小板纤维蛋白>富血小板纤维蛋白/骨基质1∶1>富血小板纤维蛋白/骨基质1∶2>骨基质>空白对照，表明富血小板纤维蛋白能够促进种植体周围骨缺损的骨生成，同时验证了富血小板纤维蛋白促进成骨的作用以及减少感染的作用。但是，并非所有的实验均证实富血小板纤维蛋白对于组织愈合是有效的。

此次实验设计的富血小板纤维蛋白分组以及样本数量有限，不能完全确定富血小板纤维蛋白有无剂量依赖性，没有证实其浓度是否与成骨效果完全呈正相关，关于富血小板纤维蛋白在成骨过程中具体的作用机制以及释放的生长因子之间有无拮抗关系等，仍需进一步的实验研究来证实。此外富血小板纤维蛋白的准备过程及离心过程也存在争议，例如不同的实验动物是否会影响其质与量，不同的学者对于离心的速度与时间有不同的观点，因此，一些作者建议在今后的研究中使用必要的离心参数[27]。在临床实践中，富血小板纤维蛋白的特点可能受患者的年龄、全身性疾病(如血小板减少症、出血性疾病、糖尿病)、营养状况、环境或种族差异、自身免疫、遗传易感性等因素影响[28,29]。例如YAJAMANYA等[29,30]发现，富血小板纤维蛋白中的纤维蛋白随着年龄的变化而变化，密度减小，变得疏松，血小板和白细胞的数量也减少。浓缩生长因子作为第3代血小板浓缩制品，在特定离心机中制备完成，是变速离心的产物，离心转速为2400-2700r/s，这是为了分离静脉血中的细胞，因此浓缩生长因子中富含纤维蛋白凝块比富血小板纤维蛋白中的大得多，而且更黏稠，纤维蛋白的含量也更多。使用富含纤维蛋白凝块时，将显示更强的再生力和更好的多样性[31]，与富血小板纤维蛋白相比具有更高的抗张强度、更多的生长因子、更好的黏性和更高的黏合强度[32]。浓缩生长因子的诸多优势为以后的研究提供了方向。

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文章来源：高玺鑫,王溪,范戌辉,崔怡,杨威,赵云转.富血小板纤维蛋白联合诱导骨基质修复兔口腔种植体周围骨缺损[J].中国组织工程研究,2022,26(14):2207-2213.