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宏基因组学二代测序技术对重症肺炎真菌感染诊断价值

2020-10-12 574 上传者：管理员

摘要：目的应用宏基因组学二代测序技术检测重症肺炎真菌感染患者病原体,探讨其诊断重症肺炎真菌感染的临床应用价值。方法重症肺炎真菌感染患者20例,其中经传统病原微生物培养(痰培养、肺泡灌洗液/胸腔积液培养)明确病原学17例,另3例符合临床诊断标准,但未明确病原学。收集患者肺泡灌洗液标本19例,胸腔积液1例,并采用mNGS进一步检测病原体。结果经传统病原学检测明确病原学17例中,7例肺孢子菌,4例白色念珠菌,3例曲霉菌,1例肺孢子菌混合鲍曼不动杆菌,1例根霉菌,1例隐球菌;另3例符合真菌感染临床诊断者,经mNGS确定病原体1例为肺孢子菌感染合并白色念珠菌,2例为肺孢子菌感染合并鲍曼不动杆菌感染。7例传统培养明确肺孢子菌感染标本中,mNGS检测发现3例同时合并曲霉菌感染。1例mNGS测定未发现真菌,而肺泡灌洗液中培养出霉菌菌丝。20例患者mNGS检测检出肺孢子菌11例,曲霉菌6例,念珠菌5例,根霉菌1例,新型隐球菌感染(胸腔积液标本)1例。曲霉菌核酸序列数分别为3、42、6788、206、46、2条,测序深度为1～1.2,覆盖度为0.004%～11.000%;念珠菌核酸序列数分别为6、152、17、4、96条,测序深度为1～1.4,覆盖度为0.009%～18.000%;肺孢子菌核酸序列数分别为17、56737、40、1050、19153、3419、420、32828、45487、5、87条,测序深度为1～1.3,覆盖度为0.05%～16.00%;新型隐球菌1例,序列数52条;根霉菌1例,序列数11条。结论mNGS可快速检测真菌感染的病原体,提高重症肺炎病原学诊断的敏感性,可作为传统微生物检测手段的有效补充方法。

关键词：
临床医学
临床诊断
基因组学二代测序技术
真菌感染
重症肺炎
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肺炎的严重性取决于局部炎症程度、肺部炎症的播散和全身严重反应程度,重症肺炎是由肺组织(细支气管、肺泡、间质)炎症发展到一定疾病阶段,恶化加重形成,引起器官功能障碍甚至危及生命,可导致严重的并发症[1]。重症肺炎患者由于免疫功能低下、长期应用抗生素等,导致合并真菌感染概率增加。传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在一定局限性,且无法快速识别未知或罕见的病原微生物。宏基因组学二代测序技术不依赖于传统的微生物培养,可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序,然后与数据库进行比对分析,根据比对到的序列信息判断样本所包含的病原微生物种类,无需特异性扩增,可快速、客观检测临床样本中较多病原微生物,对急危重症感染的诊断有重要价值[2]。本研究探讨mNGS技术在重症肺炎真菌感染诊断中的应用价值,报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2018年9月—2019年2月河南省人民医院诊治的重症肺炎真菌感染患者20例,男14例,女6例;年龄42～73(52.3±18.2)岁。入选标准:(1)重症肺炎诊断符合文献[1]标准;(2)均行传统病原微生物检测(痰、肺泡灌洗液、胸腔积液培养),以肺部真菌病临床诊断作为诊断的金标准,同时符合宿主发病危险因素≥1项、侵袭性肺真菌病的1项主要临床特征或2项次要临床特征以及1项微生物学检查依据[3]。排除标准:(1)合并各系统恶性肿瘤者;(2)孕/产妇;(3)既往病史不明确;(4)年龄<18岁者;(5)HIV感染者;(6)确诊后24h内死亡者;(7)中性粒细胞绝对值<1.0×109/L。20例中合并1种以上基础疾病17例(其中合并心血管疾病7例,高血压病10例,慢性呼吸系统疾病4例,肾功能不全及肾病综合征11例,2型糖尿病5例,血液病4例,自身免疫性疾病3例);肾移植患者2例,行静脉-静脉体外膜肺氧合生命支持患者2例;ICU入住时间10(8,17)d,死亡16例,存活4例。20例真菌感染患者均同时行mNGS进一步检测病原体。本研究经河南省人民医院伦理委员会批准通过[(2019)伦申第(37)号],患者或家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集方法

20例重症肺炎真菌感染患者中,1例采集胸腔积液标本,19例采集支气管肺泡灌洗液标本。支气管肺泡灌洗液采集方法参照文献[4],留取肺泡灌洗液标本在室温2h内送至实验室检测,若>2h则4℃保存,6～8h送检。真菌病原学、耶氏肺孢子菌、新型隐球菌检测方法及试剂结果判定均按照相关试剂说明书进行操作。取样本0.5～3mL,经玻璃珠混合震荡后按照TIANampMicroDNAKit试剂盒步骤提取DNA。

1.2.2mNGS测序及数据分析

应用Agilent2100Bioanalyzer质控文库插入片段大小。使用QubitdsDNAHSAssayKit质控DNA文库浓度,经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片,使用BGISEQ-500行mNGS测序。测序数据下机后去除低质量和长度<35bp的数据,确保高质量数据。先应用BWA去除高质量数据中人参考基因组序列的数据再去除低复杂度reads后与专用微生物数据库比对。对比结果共包含3446种细菌、1515种病毒、206种真菌和140种寄生虫,将数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列,通过SoapCoverage分析测序深度及覆盖度。

2、结果

2.1传统方法检测病原微生物结果

20例重症肺炎真菌感染患者中,17例通过传统病原学检测方法明确病原学,其中7例肺孢子菌,4例白色念珠菌,3例曲霉菌,1例根霉菌,1例肺孢子菌混合鲍曼不动杆菌(以上标本均为肺泡灌洗液培养),1例隐球菌(胸腔积液培养);另3例传统病原学检测方法无法确定病原体者,符合真菌感染临床诊断标准。

2.2mNGS检测结果

传统病原学检测方法无法确定病原菌3例中,经mNGS确定病原体1例为肺孢子菌感染合并白色念珠菌,2例为肺孢子菌感染合并鲍曼不动杆菌感染。传统培养方法中检出的7例肺孢子菌感染标本中,mNGS检测发现3例同时合并曲霉菌感染。1例mNGS检测未发现真菌,但肺泡灌洗液培养出霉菌菌丝。

20例患者mNGS检测检出肺孢子菌11例,曲霉菌6例,念珠菌5例,根霉菌1例,新型隐球菌感染(胸腔积液标本)1例。曲霉菌核酸序列数分别为3、42、6788、206、46、2条,测序深度为1～1.2,覆盖度为0.004%～11.000%;念珠菌核酸序列数分别为6、152、17、4、96条,测序深度为1～1.4,覆盖度为0.009%～18.000%;肺孢子菌核酸序列数分别为17、56737、40、1050、19153、3419、420、32828、45487、5、87条,测序深度为1～1.3,覆盖度为0.05%～16.00%;根霉菌1例,序列数11条;新型隐球菌1例,序列数52条。

3、讨论

重症肺炎真菌感染患者多存在免疫功能低下,随着我国人口老龄化问题及抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂的广泛应用,肺部真菌感染的发病率及病死率逐年上升[5]。本研究20例重症肺炎真菌感染患者中,合并1种以上基础疾病者17例,其中合并慢性肾功能不全及肾病综合征11例,该类患者可能由于长期应用激素及免疫抑制剂等治疗,存在自身细胞免疫及体液免疫功能受损,是真菌感染的高危人群[6]。尤其对危重症患者,及时明确病原微生物类型对指导治疗有重要意义。传统微生物检测技术的时效性、敏感性、特异性欠佳[7],尤其是对真菌感染的检测,因细胞壁增加了提取及检验难度,造成真菌感染患者易误诊、漏诊。

mNGS检测是对特定环境样品中的全部病原体基因组进行高通量测序,可快速、准确、高效获得整个病原体群体的基因组信息。mNGS不依赖于病原体的分离培养,可得到环境中丰度较低、甚至是痕量病原体的信息。近年来,mNGS技术已应用于医学研究及临床诊断领域,如感染类型诊断、抗性基因的鉴定和传染病的防控等[8,9]。本研究中的20例重症肺炎真菌感染患者中,通过mNGS检测明确曲霉菌感染6例,念珠菌感染5例,肺孢子菌感染11例,根霉菌1例,新型隐球菌1例。其中3例传统病原学检测方法无法确定病原体者,通过mNGS检测确定病原体为1例肺孢子菌感染合并白色念珠菌,2例为肺孢子菌感染合并鲍曼不动杆菌感染。提示mNGS可作为传统病原学检测的有效补充方法,可早期、精准发现病原体。研究[10]表明根据mNGS检测结果及时调整抗感染方案可获得满意效果,与传统病原学检测方法相比,可明显缩短患者住院时间,减少28d病死率。但本研究中1例mNGS检测未发现真菌者,其肺泡灌洗液培养出霉菌菌丝;说明mNGS仍存在错检、漏检可能,不能完全替代传统病原学检测方法。

本研究通过对临床确诊的重症肺炎真菌感染患者的肺泡灌洗液或胸腔积液标本行mNGS检测,传统培养方法明确为曲霉菌感染3例,而mNGS结果同样检测到不同序列数曲霉菌,且在传统培养方法中明确的7例肺孢子菌感染标本中发现3例合并曲霉菌感染,明确曲霉菌感染共6例。说明mNGS技术可发现传统检测方法未能或无法确诊的病原体,有助于提高感染病原菌的检出率,尤其对急危重症感染患者,可提高抗感染治疗的精准度,由以往经验性治疗逐步过渡为精准化治疗。mNGS应用存在的问题:(1)目前尚无统一的各类临床标本mNGS的前处理标准;(2)高通量测序产生的大批量数据需专业生物信息团队进行大数据分析,因较多病原体的基因组数据库尚不完善,分析成本和时间难以控制[11];(3)测序结果判读是困扰临床应用的主要问题。随着各学科的发展,mNGS可成为传统微生物检测的有效补充,为急危重症感染患者提供快速精准的诊断依据,获得精准抗感染治疗,进而降低危重患者的病死率。

参考文献：

[1]中国医师协会急诊医师分会.中国急诊重症肺炎临床实践专家共识[J].中国急救医学,2016,36(2):97-107.

[2]宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J].中华急诊医学杂志,2019,28(2):151-155.

[3]中华医学会呼吸病学分会感染学组.肺真菌病诊断和治疗专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(11):821-834.

[4]中华医学会呼吸病学分会.肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2017,8(40):578-583.

[10]卓惠长,林建东,尤彦菁.基于宏基因组学的二代测序技术在肾移植术后重症肺炎诊治中的应用[J].中华器官移植杂志,2019,40(6):361-364.

[11]李林海.宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用[J].传染病信息,2018,31(1):15-18.

贾建超,贾建敏,刘姿,张文平,马利军,程剑剑,杨金坡.宏基因组学二代测序技术对重症肺炎真菌感染诊断价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(10):1023-1025.

基金:2016年河南省基础与前沿技术项目(162300410109).