病毒、疾病标志物、生理活性物质、药物及化学物质等的检测对我们的生活具有重要意义。免疫学检测技术是基于抗原抗体反应特异性与亲和性的一种检测技术，与基于大型设备的色谱法比较，具有简单易行及检测对象选择性好等优点，被广泛应用于疾病诊断及食品安全和环境监测等领域。代表性的免疫检测技术有酶联免疫吸附试验（en⁃zyme linked immunosorbent assay,ELISA）、免疫荧光检测技术等，但其操作步骤繁琐、孵育反应时间较长，需要耗费大量劳力，而均相免疫检测无需对检测系统进行固液相的分离，操作简便、成本低，不仅用于物质检测，在生体成像方面也受到广泛关注。ABE等[1]报道了一种新型生物传感器——荧光淬体免疫探针（Quenchbody,Q-body），该技术的特点是在特定位置用荧光染料标记抗体，抗体内部色氨酸导致荧光基团发生电子转移而淬灭，当Q-body与抗原结合时荧光强度增加，从而利用荧光强度的变化检测抗原。

1、Q-body免疫检测技术的原理

Q-body是一种与荧光染料相偶联的抗体免疫传感器，通常以抗体单链可变区片段（single chain variable region,scFv）或抗原结合片段（antigen-bind⁃ing fragment,Fab）为原料，在其氮端标记荧光染料构建。Q-body的结构与原理如图1所示：当用特定的荧光染料在抗体的抗原结合部位附近进行标记时，荧光染料进入抗体内部，抗体分子特有的氨基酸能使进入抗体内部的荧光色素的荧光消失，即发生荧光淬灭，所以这类荧光标记抗体又被称为Q-body。

荧光素的发光机制为：当色素荧光团原子被激发光照射时，其电子从低能量轨道跃迁到高能量轨道，当电子回归低能量轨道时发射荧光。但当荧光色素附近有能够提供电子的氨基酸时，该氨基酸向荧光色素提供电子，使荧光素不发出荧光，即发生淬灭。色氨酸（Tryptophan,Trp）通过吲哚侧链介导光诱导电子转移从而对荧光素进行淬灭。吲哚侧链是所有天然氨基酸中最容易被氧化的官能团，在与染料分子反应时，它使Trp成为有效的电子供体。在没有抗原的情况下，荧光基团进入VH和VL，并通过疏水键和π-π堆积作用与色氨酸残基相互作用，Trp残基为处于激发态的荧光染料提供电子，从而导致荧光淬灭。而当Q-body跟抗原结合时，抗体可变区的构象发生变化并趋于稳定，荧光素从抗体内部转移到抗体外部，使淬灭解除，荧光染料的荧光强度得以恢复，因此可以通过测定荧光强度的变化检测抗原含量。

Q-body免疫分析技术操作简单，只需在探针溶液中加入样品，数秒后检测荧光强度即可完成。Q-body免疫检测技术在免疫检测及诊断中更加方便、有效，并且具有抗原依赖性，可用作抗原的定性与定量分析（图2）。

图1 抗体的结构与Q-body的基本原理

为探索Q-body的抗原依赖性特征及分子内作用机制，OHASHI等[2]通过ELISA和荧光偏振技术（fluorescence probes,FP）分析了荧光淬体与抗原的反应中染料分子活动及染料运动的动力学。ELISA结果表明，荧光染料从抗体内部移动到抗体外部区域越多，越容易被抗染料抗体捕获。此外，针对抗骨钙素（bone gla protein,BGP）抗体的单链抗体Q-body的分析证实了荧光强度随抗原浓度增加而增强的原因。其相关研究也证实了随着连接肽的长度增长，其信号逐渐减弱，这也与荧光检测的连接肽越长荧光强度峰值越低的结果一致。为进一步验证结论，该团队利用抗双酚A进行实验，结果显示一致。不同的是，在荧光检测中双酚A荧光淬体连接肽越长，荧光强度的峰值越高，ELISA也显示出一致的结果，即随着连接肽长度增长，信号的相对值增强。该团队又利用FP对荧光染料的分子动力学进行分析，发现在改变抗原存在与否、抗原浓度以及连接肽长度时的结果与ELISA结果显示一致：抗原浓度越高，越多的荧光染料被释放到抗体外部，因此染料分子的布朗运动速率增强而偏振度降低。

通过ELISA与FP证实了Q-body的抗原抗体反应与荧光基团的运动密切相关，说明荧光强度的增强是由分子内的荧光基团向外移动引起的。OHASHI等[2]认为连接肽越长，荧光基团越容易暴露于抗体，从而导致了更高的绝对信号。因此最合适的连接肽长度才可以保证荧光基团处于最佳位置，并具有更好的淬灭程度及抗原依赖性。但对于连接肽长度导致淬灭的相对程度因抗体而异的主要原因还需要进一步研究。

2、Q-body的构建

Q-body最早是在利用无细胞翻译技术，用荧光素修饰的氨酰基tRNA特异性标记蛋白质时被偶然发现的，早期的Q-body主要也是利用无细胞翻译技术合成的[3]。之后ABE等[4]报道了通过原核细胞表达Fab片段，并利用半胱氨酸与马来酰亚胺的反应对抗体片段进行标记制备Q-body的方法。这种Fab荧光淬体更加稳定，其灵敏度也比单链荧光淬体高（图3）。

图2 利用Q-body测定抗原浓度

KURUMIDA等[5]开发的能够识别人类免疫缺陷病毒基因产物之一的Nef蛋白的Q-body，能够利用体内非天然氨基酸掺入系统将荧光染料分子放置在不同位置。用DBCO-Cy3标记构建的Q-body，非天然氨基酸（unnatural amino acid,UAA)3-叠氮基-L-酪氨酸通过体内特异的UAA掺入系统被掺入抗体中。在这项研究中，该团队将一种识别人类免疫缺陷病毒抗原Nef的抗体作为原型，优化染料位置后，荧光强度最大变化为2倍。在此过程中发现，抗体中的一些色氨酸残基可以淬灭荧光。随后使用定点突变方法构建点突变表达载体，通过将编码相应氨基酸残基的密码子改为琥珀酸密码子，构建了5个突变体（T66LAzY、L67LAzY、S69LAzY、S101LA-zY和S12LAzY），对抗原表位的分析表明，抗原中位于表位附近的一些氨基酸残基影响了荧光强度。

在无细胞翻译系统中获得的有限产量导致产品成本的增加，利用大肠杆菌表达抗体片段必须要进行载体构建、蛋白表达和纯化，需要耗费大量时间[6]。DONG等[7]在Q-body制备技术上也不断创新，研发了基于转氨作用的抗体标记技术，可将全长抗体进行简单的定点标记，制备基于全长抗体的Q-body。转氨反应是一种包含氨基的氨基酸和包含酮基的酮酸之间的化学反应。在转氨反应中，一个分子上的NH2基团与另一个分子上的=O基交换。这种反应可以描述为胺或酰胺阴离子对胺或铵盐的亲核取代。GILMORE等[8]报道了一个位点特异性转氨反应：该反应在蛋白的氮端引入一个新的酮基，并与5'-磷酸吡哆醛进行孵育。该反应引入的羰基在天然蛋白质中并不存在，因此，通过形成腙或稳定的肟键，它们被用作合成基团的独特附着点[9]。WITUS等[10]报道了一种改进的蛋白质反胺化试剂——N-甲基吡啶-4-醛苯磺酸盐（拉波伯特盐），其对反应条件要求较低。DONG等[7]使用两种荧光探针制备Q-body：商业化的aminooxy-5(6)-TAMRA和自制的TAMRA-C5-肽-肼。两种类型的Q-body表现出不同的行为。在盐酸胍变性实验中，荧光强度增加1.95到3.5倍，其制备的BGP荧光淬体检测限（limit of detection,LOD）为10 nmol/L，与使用相同抗体片段（20 nmol/L）的竞争性ELISA相似甚至优于后者[11]。

图3 Fab荧光淬体的制备及检测原理

制备Q-body的染料通常标记到抗体片段的N端，靠近抗体的抗原结合口袋，但不干扰Q-body的抗原结合活性。已经通过使用体外翻译系统或翻译后的方法将含染料的肽与抗体的Fab或scFv的N端进行基因融合，实现了对位于肽标签中的半胱氨酸残基的位点特异性标记。在ALVES等[12]基于吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid,IBA）通过紫外线辐射交联至核苷酸结合位点（nucleotide-binding site,NBS）的Fab和IgG的半位点特异性缀合策略的基础上，JEONG等[13]开发了利用核酸结合部位的修饰技术来制作Q-body。该团队构建了BGP的单链抗体，并确认在抗体内部含有由Y91H、W103H、Y36L和F98L组成的核苷酸结合位点，合成了IBA-C8-TAMRA，并利用254 nm的紫外线照射将TAMRA连接到抗体片段上，制作了Q-body，当探针与BGP-C7混合后，探针的荧光强度提高了9倍，表现出了极好的检测效果。

3、Q-body用于免疫检测

蛋白质的磷酸化是细胞内信号转导的关键，波形蛋白是细胞中含量最丰富的中间丝蛋白，其结构和功能特征基团被磷酸化修饰后，可影响细胞的生物学特性。JEONG等[14]利用荧光淬体探针检测了波形蛋白Ser71(PS71）和Ser82的磷酸化（PS82）。

Q-body可用于药品及毒品的检测，氟伏沙明（fluvoxamine,FLV）是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，用于治疗抑郁症和强迫症，FLV中毒病例随着处方数量的增加不断增加[15-16]。SASAO等[17]创建了用于检测FLV的Q-body，并确定了达到最高荧光强度（FI）的最佳条件。此外TSUJIKAWA等[18]还开发了一种Q-body用于大麻检测。

Q-body还可用于小分子物质及多肽的检测，雷帕霉素是最常用的免疫抑制药物之一[19]。JOENG等[20]报道了一种灵敏的Q-body传感器，对雷帕霉素进行检测。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是由镰刀菌及暗镰刀菌等产生的单端孢菌素霉菌毒素，对包括小麦、大麦和玉米在内的农产品产生污染[21-22]。YO⁃SHINARI等[23]利用脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体序列信息合成单链抗体基因，并制作了Q-body。当用于检测小麦提取物时，表现出抗原依赖性的荧光增强。相较于免疫层析检测试剂盒，LC-MS/MS和Q-body法测定的结果具有更高的相关性。SHAO等[24]还开发了一种检测新烟碱类农药吡虫啉荧光淬体。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）是一种神经退行性疾病，β-淀粉样蛋白（Aβ）是其标志性蛋白，其中Aβ-42是主要的肽形式，可快速聚集并表现出较高的神经毒性[25]。最近的研究表明，Aβ寡聚体如Aβ衍生的可扩散配体比原纤维的毒性更强[26]。DONG等[27]开发了一种快速检测Aβ-42及ADDL的Q-body，并成功用于检测。

Q-body不仅用于检测小分子及多肽，同样可以用于蛋白质等大分子物质的检测。整合膜蛋白（Claudin,CL）是在紧密连接中发现的膜蛋白，在建立细胞间屏障中起主要作用，该蛋白在一些在肿瘤细胞上异常过表达，是临床上用于癌症诊断的重要指标。JEONG等[28]构建了基于抗体Fab片段的Q-body，用于肿瘤细胞上过表达的CL的检测和成像。利用Q-body几分钟内即可完成抗原定量，在溶液中和细胞上均呈现出对CL高灵敏度，以及便捷的检测和成像结果。流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，对人类健康造成了严重后果[29]。甲型流感病毒具有编码1～18个血凝素（HA或H）表面蛋白的基因（H1～H18），其促进病毒附着于宿主细胞表面，并渗透到细胞中；它们还具有编码1～11个神经氨酸苷酶（NA）表面蛋白的基因（N1～N11），与宿主细胞中病毒子代的释放有关[30-31]。2009年猪源的甲型H1N1流感病毒导致了21世纪的第一次大流行，感染导致约10万人死亡，目前仍在全球范围内传播[32]。JEONG等[33]利用大肠杆菌的表达和基于硫醇的荧光标记方法，生产了一种能够识别流感HA的Q-body。该团队通过使用抗HA抗体FI6v3的cDNA制备了两种类型的基于Fab的Q-body，其LOD为（165±38) ng/ml，这与开放夹心ELISA的抗H5N1HA Fab(100 ng/ml）的值相似，有望成为现场诊断流感病毒的可靠手段[34]。

人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2），是一种受体酪氨酸激酶，通常控制哺乳动物细胞的分化和增殖[35]，是乳腺癌诊断和靶向治疗的重要生物标志物[36]。DONG等[37]构建的UQ-body用于高灵敏度地检测溶液中或癌细胞表面的HER2，进而用于杀伤肿瘤细胞。该团队选择从合成的噬菌体抗体库中筛选到的抗HER2抗体片段Fab37，制备的UQ-body能够超敏检测溶液中HER2的含量[38]。

4、Q-body用于生物成像及生物治疗

Q-body的构建是基于抗体，因此保留了抗体的特异性，可以准确地对抗原浓度进行定量，如抗原位于细胞表面，可用于细胞的荧光染色。传统的荧光染色通常需要一次抗体及荧光标记的二次抗体，在一次抗体与抗原结合结束后需要洗板以降低背景。而Q-body与细胞表面结合时其荧光强度增强，降低了荧光背景，可以忽略洗涤步骤。JEONG等[28]在用Q-body检测阳性癌细胞CL4时能观察到具有低背景的清晰荧光信号。DONG等[27]的UQ-body可用于在低背景下对聚集的Aβ成像，表明UQ-body具有快速生物成像的潜力。以上研究表明，Q-body可作为一种在体外和体内检测癌细胞表面标志物的工具。

DONG等[37]同样在无需任何洗涤步骤的条件下完成HER2阳性细胞的荧光成像。他们还利用UQ-Body作为载体，通过在其C-末端添加一个连续的9个精氨酸（9R）序列来传递siRNA，以探索其作为RNAi递送介质对HER2阳性癌细胞的治疗作用。为实现siRNA对肿瘤细胞的高效杀伤，选用Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,Plk1）作为靶蛋白。UQ-body-9R在细胞内传递的Plk1 siRNA可有效杀伤HER2阳性的癌细胞。这一新方法利用结合siRNA的UQ-body，可方便、灵敏地检测HER2抗原并成像，有效杀伤HER2阳性癌细胞。因此Q-body可以作为一种递送载体，将治疗药物靶向递送，成为严重疾病，特别是癌症的理想治疗工具。

表1 不同荧光淬体特点描述

5、Q-body技术的展望

Q-body检测技术作为一种快速检测技术，可用于小分子、多肽、蛋白质等一系列物质的检测，而使用多种染料标记的Q-body则可以同时检测同一样品中的多种物质。Q-body作为一种新型的免疫探针在物质检测及生体成像上都具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

参考文献:

[29]刘杨,赵向绒,郭春艳,等.甲型流感病毒H1N1单克隆抗体特性鉴定和应用[J].中国免疫学杂志,2021,37(9):1094-1099.

基金资助:国家自然科学基金(21775064);

文章来源:赵广伟,陈浩,董金华.新型均相免疫分析技术——荧光淬体免疫探针分析[J].中国免疫学杂志,2024,40(10):2223-2228.