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鼻息肉免疫调节中树突状细胞的作用机制观察分析

2020-07-07 235 上传者：管理员

摘要：目的探究树突状细胞在鼻息肉免疫调节中的作用机制。方法选择2017年1月至2019年10月华中科技大学协和江北医院从过敏免疫诊所、耳鼻喉科诊所和鼻窦中心招募带有鼻息肉的慢性鼻窦炎患者304例，根据治疗方式分为三组：对照组（鼻中隔手术的104例患者的正常中鼻甲黏膜组织）；鼻息肉组（100例鼻息肉患者治疗前的患者）和糖皮质激素组（100例鼻息肉患者糖皮质激素治疗7d）。通过免疫组织化学染色检测鼻息肉组织树突状细胞数目。通过实时反转录聚合酶链式反应技术检测CD14、CD56和CD83 mRNA表达。通过流式细胞术分析嗜酸性粒细胞、Th1和Th2。通过蛋白质免疫印迹检测炎症因子[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、IL-4、IL-5和IL-13]蛋白表达。结果与对照组相比，鼻息肉组树突状阳性细胞数目增加，糖皮质激素治疗后树突状阳性细胞数目降低（P<0.05）。与对照组相比，鼻息肉组CD14、CD56和CD83 mRNA表达增加，糖皮质激素治疗后CD14、CD56和CD83 mRNA表达降低（P<0.05）。与对照组相比，鼻息肉组嗜酸性粒细胞和Th2升高，Th1降低。糖皮质激素治疗后嗜酸性粒细胞和Th2降低，Th1升高（P<0.05）。与对照组相比，鼻息肉组TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达增加，糖皮质激素治疗后TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达降低（P<0.05）。结论鼻息肉组织中髓系树突状细胞（myeloid dendritic cells,mDC）升高，mDC1的标记水平与鼻息肉中的Th2炎症相关。糖皮质激素治疗干扰后，树突状细胞可以抑制Th2细胞因子的表达并诱导Th1细胞因子的分泌。

关键词：
免疫调节
慢性鼻窦炎
树突状细胞
糖皮质激素
鼻息肉
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慢性鼻窦炎是一种异质性疾病，其特征是上呼吸道和鼻窦局部发炎，持续至少12周[1,2]。根据组织学和体格检查，慢性鼻窦炎通常分为两类：带有息肉的慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP）和不带息肉的慢性鼻窦炎（Chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSs NP)[3]。CRSs NP具有1型炎症的特征[4]。对CRSwNP中的炎症进行了深入研究显示2型炎症和鼻息肉中的嗜酸性粒细胞增多。嗜酸性鼻息肉中的炎症主要由2型细胞因子IL-5和IL-13控制，IL-4和IL-13可由Th2细胞免疫细胞产生[5]。IL-5强烈诱导嗜酸性粒细胞增多。IL-13激活巨噬细胞、B细胞和上皮细胞，诱导嗜酸性粒细胞和Th2细胞的募集，IgE介导的反应和重塑[6]。CRSwNP与鼻塞和嗅觉丧失的临床主诉密切相关，其特征在于嗜酸性粒细胞增多和Th2相关的炎症[7]。尚未确定CRSwNP中Th2相关炎症扩增的基础机制。树突状细胞是主要的专业抗原呈递细胞，通过连接先天性和适应性免疫应答，在宿主免疫中发挥关键作用[8]。树突状细胞是许多炎症性疾病的关键调节剂，包括特应性皮炎和哮喘[9]。本研究中旨在探究树突状细胞在鼻息肉免疫调节中的作用机制。

1、资料与方法

1.1临床资料

选择2017年1月至2019年10月华中科技大学协和江北医院从过敏免疫诊所、耳鼻喉科诊所和鼻窦中心招募带有鼻息肉的慢性鼻窦炎患者304例。根据治疗方式分为三组：对照组（鼻中隔手术的104例患者的正常中鼻甲黏膜组织），其中，男56例，女48例，平均年龄（48.23±9.17）岁；鼻息肉组（100例鼻息肉患者治疗前的患者），其中，男52例，女48例，平均年龄（48.99±11.12）岁；糖皮质激素组（100例鼻息肉患者糖皮质激素治疗7d），其中，男50例，女40例，平均年龄（47.20±8.56）岁，组间差异无显著性（P>0.05）,具有可比性。纳入标准：(1)所有受试者均符合美国耳鼻咽喉科—头颈外科慢性鼻窦炎工作队所定义的慢性鼻窦炎标准[3];(2)年龄20～65岁，性别不限；(3)临床资料完整。排除标准：具有确定的免疫缺陷、妊娠、凝血功能障碍或诊断为典型的过敏性真菌鼻窦炎，Churg-Strauss综合征或囊性纤维化；有严重躯体疾病；合并恶性肿瘤；严重精神类疾病。所有受试者均签署了知情同意书，并且该研究得到本院伦理审查委员会的批准。糖皮质激素治疗措施：术前1周给予泼尼松每日30mg，口服，术日早晨肌内注射地塞米松10mg，术后仍予泼尼松30mg/d，维持1周，再改用鼻内糖皮质激素，视情况应用4～12周。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学

鼻组织脱水，石蜡包埋，3%H2O2/甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，用5%马血清/磷酸缓冲盐溶液阻断组织切片，抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒处理。将玻片与10µg/ml小鼠抗人CD1c mAb在封闭缓冲液中于4℃孵育过夜。一抗处理后与生物素化的马抗小鼠IgG在室温下孵育1h,ABC试剂（抗生物素蛋白—生物素-HRP复合物）孵育1h,DAB试剂中室温孵育5min。去离子水冲洗，用苏木精复染、脱水、清洗，显微镜下计数鼻黏膜中阳性细胞数量。

1.2.2实时反转录聚合酶链式反应

通过用Rhinoprobe刮宫术从鼻息肉收集鼻上皮刮屑，使用QIAzol从鼻窦组织中提取总RNA，并根据制造商的说明使用Nucleospin RNAⅡ试剂盒清洗并用DNase I处理。用SuperScriptⅡ反转录酶和随机引物合成单链c DNA。使用TaqMan方法在Applied Biosystems 7500序列检测系统上以15µl反应进行半定量实时反转录聚合酶链式反应技术。10 ng总RNA的cDNA等分试样用于实时反转录聚合酶链式反应技术，将m RNA表达标准化为管家基因β-葡萄糖醛酸苷酶的中值表达。

1.2.3细胞分离和流式细胞仪分析

称重样品后打碎，与30µg/ml DNase I和1 mg/ml I型胶原酶在4℃下孵育过夜，70µm尼龙网过滤细胞。红细胞裂解液处理后杜氏磷酸缓冲液洗涤，计数和染色以进行流式细胞术分析。

1.3统计学处理

采用SPSS 20.0统计分析软件处理；计量资料采用“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P<0.05代表差异有显著性。

2、结果

2.1鼻息肉中树突状细胞的数量增加

对照组树突状细胞数目为（122.62±15.87）个；鼻息肉组树突状细胞数目为（283.46±21.52）个；糖皮质激素组树突状细胞数目为（167.94±17.35）个。与对照组相比，鼻息肉组树突状阳性细胞数目增加，糖皮质激素治疗后树突状阳性细胞数目降低（P<0.05）。

2.2树突状细胞标志物在鼻息肉中的表达

与对照组相比，鼻息肉组CD14、CD56和CD83 mRNA表达增加，糖皮质激素治疗后CD14、CD56和CD83mRNA表达降低（P<0.05），表1。

表1树突状细胞标志物m RNA表达（积分光密度值，±s)

2.3流式细胞术进行分析嗜酸性粒细胞、Th1和Th2

与对照组相比，鼻息肉组嗜酸性粒细胞和Th2升高，Th1降低。糖皮质激素治疗后嗜酸性粒细胞和Th2降低，Th1升高（P<0.05），见表2。

表2流式细胞术进行分析嗜酸性粒细胞、Th1和Th2（个，±s)

2.4炎症因子在鼻息肉中的表达

与对照组相比，鼻息肉组TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达增加，糖皮质激素治疗后TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达降低（P<0.05），见表3。

表3炎症因子蛋白表达（±s)

3、讨论

与CRSs NP或对照窦黏膜相比，CRSw NP具有2型炎症和嗜酸性粒细胞增多的特征[10]。但是，CRSw NP中的炎症因种族和地区差异而异。CRSw NP中70%～90%在鼻息肉中显示出嗜酸性粒细胞增多。鼻息肉中的嗜酸性粒细胞大量浸润，嗜酸性粒细胞在固有层和鼻息肉的上皮中高度积累。除了激活和存活之外，嗜酸性粒细胞募集到组织中是诱导嗜酸性粒细胞增多的另一个关键事件。趋化因子是一大类蛋白质，它们通过结合靶细胞上的G蛋白偶联受体来参与将炎症细胞募集到组织部位。其中，趋化因子受体CCR3主要在嗜酸性粒细胞上表达，其中5种趋化因子分别为MCP-4(CCL13),RANTES(CCL5),eotaxin-1(CCL11),eotaxin-2(CCL24）和eotaxin-3(CCL26)[11]。已知树突状细胞在使黏膜中的Th反应偏向中很重要。人类树突状细胞可以分为两个主要的子集：髓系树突状细胞（myeloid dendritic cells,mDC）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells,pDC)[12]。髓系树突状细胞充当强抗原呈递细胞，其关键功能之一是控制T辅助细胞的极化。相反，pDCs在抗原呈递方面不如mDCs有效，但会强烈促进抗病毒免疫[13]。CD1c和CD141分别在细胞表面表达。研究进一步区分m DC表型，发现鼻息肉中的m DC1和mDC2均升高，尽管mDC2是鼻息肉中的一小部分mDC[14]。鼻息肉中mDC2的升高可能有助于局部Th2极化环境[15]。与mDC2相反，部分识别了与mDC1相关的Th2极化的机制。从嗜酸性或非嗜酸性鼻息肉分离出的mDC1可使原始T细胞偏向Th1和Th17表型，但只有嗜酸性鼻息肉的树突状细胞才能够使天然T细胞偏向Th2表型。嗜酸性鼻息肉中的mDC1s可能由TSLP启动，并随后控制鼻息肉中的Th2反应[16]。

本研究显示，与对照组相比，鼻息肉组TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达增加，糖皮质激素治疗后TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达降低。笔者分析认为，由于已知TSLP强烈诱导趋化因子、TARC、mDC和eotaxin的产生，因此在m DC中，嗜酸性鼻息肉中的78个mDC1也可能有助于Th2细胞和嗜酸性粒细胞募集到鼻息肉中。鼻息肉组嗜酸性粒细胞和Th2升高，Th1降低。糖皮质激素治疗后嗜酸性粒细胞和Th2降低，Th1升高。IL-4、IL-5和IL-13在内的2型细胞因子可控制嗜酸性CRSwNP中的炎症。IL-5是鼻息肉中嗜酸性粒细胞的关键活化和存活因子。相反，IL-4和IL-13是控制上皮细胞黏液产生以及B细胞和浆细胞中IgE反应的关键因素。IL-4和IL-13还可促成鼻息肉中的几个关键炎症事件，包括巨噬细胞的激活和重塑。2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13可由几种免疫细胞产生，包括Th2细胞、肥大细胞和第2组先天淋巴样细胞。在这些细胞类型中，可以通过适应性信号传导和先天性信号传导来诱导2型细胞因子。笔者推测，GC通过降低细胞中IL-12的产生，可潜在地间接增加Ih2细胞因子的合成，即糖皮质激素治疗有效可纠正这些细胞因子的偏移，说明糖皮质激素不仅有较强的免疫抑制作用，还有一定的免疫调节作用。

综上所述，本研究报道的鼻息肉组织中m DC升高，m DC1的标记水平与鼻息肉中的Th2炎症相关。糖皮质激素治疗干扰后，树突状细胞可以抑制Th2细胞因子的表达并诱导Th1细胞因子的分泌。因此，树突状细胞和嗜酸性粒细胞都可能在促进鼻息肉的发展和进程中发挥作用，但是其潜在机制需要进一步研究。

参考文献：

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[7]孟一帆,娄鸿飞,王成硕,等.鼻窦CT在诊断嗜酸粒细胞性慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉中的价值[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2017,52(2):93-98.

[10]许欢,林玉玲,魏鑫鑫.PACAP蛋白在慢性鼻窦炎—鼻息肉组织中的表达及其临床意义[J].中国试验诊断学,2019(3):458-460.

[12]杨焕焕,方红,尤权杰,等.组织嗜酸粒细胞及鼻窦CT对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉术后复发的预测研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2018,53(11):842-846.

[14]黄远,余文兴,杜进涛,等.慢性鼻窦炎鼻息肉中转录因子NKX2-1调控嗜酸性炎症反应的作用[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2018,32(4):17-23.

周本益,戴珊,刘忠纯.树突状细胞在鼻息肉免疫调节中的作用机制[J].中国临床医生杂志,2020,48(07):821-823.

基金:国家自然科学基金资助项目(81271496).