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观察分析婴儿IL-36受体拮抗剂缺陷病临床免疫学特点和基因突变研究

2020-07-07 583 上传者：管理员

摘要：目的探讨1例新生儿期发病的女性婴儿IL-36受体拮抗剂缺陷病临床特征、免疫学特征及基因突变。方法收集该患者的临床资料。获取外周血标本行相关基因测序，利用流式细胞术和酶联免疫吸附试验分别进行外周血淋巴细胞精细免疫分型及细胞因子测定。结果患儿IL36RN基因第3内含子拼接位点发生c.115+6T>C纯合突变，父母为相同位点杂合突变。流式细胞术检测结果示患儿外周血淋巴细胞亚群比例及数量正常。酶联免疫吸附试验发现血清IL-6、IL-10水平增高。予以益赛普治疗后患儿全身脓疱消退，5月后随访无复发，随访中未发现感染等并发症。结论 IL-36受体拮抗剂缺陷病由IL36RN基因突变致天然免疫失控引起，益赛普是治疗药物的选择之一。

关键词：
IL-36受体拮抗剂缺陷病
免疫系统
无菌性脓疱
泛发性脓疱型银屑病
益赛普
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泛发性脓疱型银屑病（general pustular psoriasis,GPP）是银屑病的一个少见亚型，临床以红斑基础上发生粟粒大小的无菌性脓疱、全身潮红为特点，迅速泛发全身、并且常常复发，伴有周期性高热、寒战、皮肤疼痛等全身不适，白细胞增多症，C反应蛋白显著升高，肝肾功能受损。如未接受及时治疗可危及生命。2011年Slaheddine等对9个GPP患者的家族研究发现由特异性的基因缺陷：IL36RN基因突变所致[1]，称之为IL-36受体拮抗剂缺陷病（deficiency ofinterleukin-36 receptor antagonist,DITRA）。IL36RN(NM＿012275）是编码IL-36受体拮抗剂（IL-36Ra）的基因，可通过阻止IL-36与其受体结合而阻断促炎信号通路。本病与编码IL-36受体拮抗剂的IL36RN基因突变和凋亡蛋白酶募集结构域家族成员14(caspase recruitment domain family member 14,CARD14）功能获得性突变直接引起[2]。本文对就诊于我院的1月龄婴儿在新生儿期发病的DITRA进行报道，旨在提高临床上对该病的认识和提供治疗经验参考。

1、资料与方法

1.1临床资料

患者女，1月3/30天龄。2周龄时颜面部、躯干、双下肢出现散在针尖-粟粒大小脓疱，脓疱逐渐增多、融合。1月龄时皮疹加重，表现为全身泛发粟粒大小脓疱，头面部和躯干脓疱部分融合成片，表现为大片红斑基础上密集分布的脓疱和脓湖，未累及腔口黏膜，病程中无发热、咳嗽、腹泻。患儿为G2P2，足月，自然分娩，出生体质量3.25 kg，母孕期身体状况正常，G1P1为男孩，现13岁，体健，无类似病史。患儿出生后母乳喂养，生长发育正常，现可抬头片刻，已接种乙肝疫苗第一针，无明显即刻接种后反应。近期无药物、特殊食物服用史。父母身体状况好，否认家族类似病史，非近亲婚配。

体格检查：神志清，精神可。呼吸平稳规则。体质量5 kg。腹软，肝脏肋下触及1.5 cm，剑突下触及1.5 cm，质软、边缘锐、表面光滑、无触痛，脾脏肋下未触及。专科查体：头面部、躯干及四肢泛发大量粟粒大小脓疱、脓湖，面部和躯干多数脓疱融合成片，表现为大片红斑基础上密集分布的脓疱、脓湖，见图1。

图1患儿临床表现

实验室及辅助检查：血常规：白细胞11.65×109/L，淋巴细胞百分比0.72，中性粒细胞百分比19%,C反应蛋白<8 mg/L；肝肾功能：总胆红素24.8μmol/L，直接胆红素10.8μmol/L；白蛋白37.5 g/L，谷丙转氨酶205 U/L，胆汁酸36.3μmol/L；脓疱疱液培养：未见细菌、真菌生长。皮肤病理检查：表皮角化过度及角化不全，表皮棘层内见微脓肿形成；颗粒层变薄，棘层增厚，表皮海绵样改变，表皮突增长，真皮层中小血管增多、扩张，散在淋巴细胞浸润，见图2。

图2患儿皮肤组织病理检查

治疗经过：因患儿肝功能异常，故未予以阿维A、甲氨蝶呤，与患者家属沟通后同意使用重组II型肿瘤坏死因子受/抗体融合蛋白（益赛普）2.0 mg皮下注射2次/周，1周后患儿全身脓疱干涸，无新发脓疱，红斑颜色变淡，躯干鳞屑大部分脱落。前2个月每周2次，后减量为每周1次共3月。治疗期间患者无新发皮疹，治疗过程中未发现感染等副作用。5月后肛周有少量新发脓疱，无发热，外用地奈德乳膏后可自行消退，见图1d。患儿肝功能损害可能与本病处于进展期相关，予以阿拓莫兰及复方甘草酸苷保肝等治疗，后复查肝功恢复正常。

1.2基因DNA二代测序及cDNA一代验证

取得患儿家属知情同意后，采集患儿及父母外周血各500μl,肝素抗凝处理。用基因组DNA提取试剂盒（百泰克，北京）提取总DNA，用RNA提取试剂盒（百泰克，北京）提取总RNA并逆转录为cDNA(Takara，日本）。取3μl DNA样本，用液相捕获试剂盒（GenCap Tmprbe）捕获目标区域DNA片段；构建DNA基因文库，富集DNA短片段，用Illumina HiSeq2000测序仪进行高通量测序，并于SOAPaligner软件中将数据与人类基因组数据相对应；于目标区域定位基因型（迈基诺基因科技有限责任公司）。同时根据IL36RN基因mRNA序列，应用Primer Premier 5.0软件设计mRNA特异性引物，BALST比对确定引物特异性，琼脂凝胶电泳验证后的PCR产物测序，测序结果于NCBI中进行比对验证。

1.3免疫学筛查

利用酶联免疫吸附试验进行外周血行细胞因子水平筛查。取患儿外周100μl肝素锂抗凝血行淋巴细胞精细免疫分型，方法同陈智等文中报道[3]，流式细胞仪检测T、B、NK淋巴细胞各亚群的相对数。淋巴细胞各亚群的绝对数通过公式：淋巴细胞绝对数×淋巴细胞各亚群占淋巴细胞的相对数计算得出。所用仪器为美国BD Biosciences的流式细胞仪。使用抗体均由BD公司和Biolegend公司提供。

2、结果

2.1基因突变结果

患儿IL36RN基因第3内含子发生c.115+6T>C纯合突变，为拼接位点突变，导致p.Arg10Argfs*1，第3号外显子被剪切，第2号和4号外显子直接拼接，提前产生终止密码子从而提前终止蛋白质翻译。一代验证证实患儿父母为杂合携带者（图3）。

图3患儿及父母IL36RN基因测序结果

2.2血清细胞因子水平

患儿外周血细胞因子检测结果见表1，其血清IL-6、IL-10水平增高，TNF-α、IFN-γ等正常。

表1患儿外周血血清细胞因子水平

2.3淋巴细胞精细免疫分型

患儿外周血淋巴细胞精细免疫分型结果见表2，其外周血淋巴细胞亚群比例及数量正常。

表2患儿精细免疫分型结果

3、讨论

根据本例患儿临床表现为反复发作的红斑、脓疱，结合皮肤病理检查，同时基因检测显示IL-36RN基因c.115+6T>C纯合突变，诊断为IL-36受体拮抗剂缺陷病（deficiency of interleukin-36 receptor antagonist,DITRA）。该病由于炎症因子的过度分泌，近年来被定义为原发性免疫缺陷病，归属于“自身炎症性疾病”[4]。IL-36是IL-1家族成员，由3个生物学功能相似的分子：IL-36α、IL-36β及IL-36γ组成，可激活促炎症反应信号通路如核转录因子NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）而引起炎症反应[2]。该婴儿IL-36受体拮抗剂基因IL36RN的突变为c.115+6T>C，该拼接位点突变导致提前产生终止密码子，翻译出仅含10个氨基酸的异常Il-36Ra（正常为155个氨基酸），引起过度炎症反应。

除基因因素以外，诱发因素还可能包括感染（葡萄球菌、VZV、HSV、念珠菌等）、系统性糖皮质激素减量或停用、情绪压力、疫苗接种等。本例患儿在2周龄时即发病，可能为报道中最早发病的婴儿之一。在发病前无明显用药史及上呼吸或消化道、泌尿道感染症状，但在病程中出现了肝功能异常，尚未找到明显噬肝病毒感染证据，因此考虑为本病的系统表现之一。

参考美国银屑病基金会医事委员会工作小组所建议的方案[5]：一线治疗包括阿维A(<1 mg∙kg-1∙d-1）、环孢素（1～3 mg∙kg-1∙d-1）、甲氨蝶呤（每周0.2～0.4 mg/kg）及益赛普（0.4 mg∙kg-1∙d-1）。本例患儿因肝功能异常，故未予以维A酸及甲氨蝶呤，予以益赛普2.0 mg皮下注射2次/周，1周后患儿全身脓疱干涸，2个月后随访，患者无新发皮疹，治疗过程中未发现明显感染等不良反应。5个月后肛周有少量新发脓疱，无发热，外用弱效糖皮质激素软膏后可消退。益赛普为p75 TNF（肿瘤坏死因子，tumor necrosis factor）受体融合蛋白，可结合TNF-α起到抑制炎症的作用，既往报道无明显感染性不良反应报道[6]。与另一种TNF-α抑制剂英夫利西（结合TNF-α的单克隆抗体）不同，英夫利西治疗儿童GPP有出现致死性败血症的病例报道[7]，且在治疗过程中有一过性脓疱加重情况发生[8]。

本研究还进行了DITRA患者淋巴细胞亚群相关研究，患儿免疫学评估提示患儿抗体水平正常，淋巴细胞亚群比例及数量无异常，说明患儿反复发生皮肤炎症并非适应性免疫系统异常导致，结合患儿血清IL-6、10增高，提示其与天然免疫相关性更高。文献报道，在GPP患者皮损内，天然免疫细胞的过度浸润导致IL-1、IL-36、TNF-α、IFN-γ、IL-17等细胞因子增高，但本例患儿血清未见明显异常，提示更多累及皮肤。由于患者皮损内以上细胞因子的增高，除TNF-α抑制剂外，最近有IL-1受体拮抗剂（阿那白滞素）[9]、IL-17单抗（secukinumab，苏金单抗）[10]治疗DITRA的报道，也取得较好的临床效果。

类似的，Cuperus报道了1例2个月龄的DITRA患者，使用益赛普和阿维A治疗，观察到了良好治疗效果[11]，而我们的病例则更具有挑战性，患儿在新生儿期2周龄的时候就发生了全身的脓疱。在婴儿早期准确判断泛发脓疱是否为严重的感染性疾病或者炎症性疾病十分重要，基因检查对于明确诊断起到决定性作用。

参考文献：

[3]陈智,宋雪瑞,薛秀红,等. 1例NEMO-ID患儿临床与免疫学特征研究[J].免疫学杂志, 2019, 35(5):428-433.

蒋金秋,倪兵,田志强,白晓明,罗晓燕,王华,任发亮.婴儿IL-36受体拮抗剂缺陷病临床免疫学特征及基因突变研究[J].免疫学杂志,2020,36(07):612-616.