上皮性卵巢癌是妇科恶性肿瘤女性的主要死亡原因，尽管目前有多中新的治疗方法，但总体预后仍然很差，超过75%的卵巢癌患者处于疾病晚期，其5年生存率小于30%[1]。T淋巴细胞表面表达程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1）蛋白，它可通过识别程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1）引起免疫逃逸，从而促进肿瘤细胞的生长和转移，肿瘤免疫逃逸被认为是癌症发生和发展的重要标志[2]。近年来也有研究发现PD-L1水平的上调可能是由于STAT通路的上调引起的，研究显示PD-L1可通过STAT3的上调而过表达[3]。微小RNA(microRNA,miRNA）可通过靶向靶基因的信使RNA(message RNA,mRNA），在转录后水平上调剂基因的表达从而参与肿瘤的发展，并且miRNA在肺癌中的调控作用在近年来被广泛的发现[4]。miR-195-5p是一种新发现的肿瘤相关的miRNA，可通过抑制靶基因的表达发挥抑癌作用，如肾细胞癌、肺癌、宫颈癌以及胃癌等[5,6,7]。最新有研究显示miR-195-5p具有调节免疫的作用，高水平的miR-195-5p会促进细粒棘球绦虫感染的宿主的免疫应答反应[8]。本次研究发现miR-195-5p可通过靶向抑制STAT3的表达抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭，并抑制免疫抑制相关蛋白PD-L1的表达，现报道如下。

1、材料与方法

1.1主要材料和仪器

人卵巢癌细胞系SKOV-3购自MEMDulbeccos modificationATCC公司（美国）。DMEM(Dulbecco’s modificationof Eagle’s medium）培养基购自Invitrogen公司（美国）。miR-195-5p类似物（mimic）、STAT3过表达质粒以及阴性对照（negative control,NC）由Thermo Fisher公司（美国）设计和合成。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司（加拿大）。细胞计数试剂盒-8(CellCounting Kit-8,CCK-8）试剂盒和结晶紫染色试剂盒购自Beyotime生物技术研究所（中国）。Transwell小室购自和Becton Dickinson公司（美国）。PCR引物由Genewiz公司（中国）设计和合成。Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）。逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix q PCR试剂盒（Roche公司，瑞士）。ABI 7500 PCR检测系统（Life technology公司，美国）。Anti-STAT3、anti-PD-L1以及二抗购自Abcam公司（美国）。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。倒置显微镜（Olympus IX71,Tokyo,Japan）。

1.2 miR-195-5p靶向STAT3位点预测和验证

通过工具网站starbase预测miR-195-5p靶向STAT3的结合位点[9]，然后通过双荧光素酶报告验证。将野生型STAT3:3'-UTR(STAT3-wt,5'-GUUUAUAAGCUGCU-3’）或突变的STAT3:3'-UTR(STAT3-mut,5'-ACCCGCCAUCAUC-3）以及miR-195-5p mimic克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。将SKOV-3细胞接种在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000用2种载体转染24 h。使用荧光素酶报告检测仪评估荧光素酶活性。

1.3细胞培养、分组和转染

将SKOV-3细胞系在含有10%FBS的DMEM培养基中培养，温度为37℃，CO2浓度为5%，相对湿度为100%。将细胞分为4组，即对照组、mimic组、mimic+STAT3组和STAT3组。使用Lipofectamine 2000试剂盒进行瞬时转染，在转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4 qPCR检测miR-195-5p、STAT3和PD-L1mRNA

通过Trizol获得细胞中总RNA，使用逆转录cDNA试剂盒将1μg RNA成熟体进行逆转录实验合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR实验，GAPDH和U6作为内参，通过比较循环阈值（ΔΔCt）用于分析RNA的表达。引物序列如下，miR-195-5p上游：5'-UAGCAGCACAGAAAUAUUG GC-3'，下游：5'-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3';PD-L1上游：5'-CTTCTTATTATGCCTTGGTGTT GCA-3'，下游：5'-GGAATACGTCTCCTCCAAATGT G-3';U6上游：5'-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3'，下游：5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3';GAPDH上游：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3’。

1.5 Western blot检测STAT3和PD-L1蛋白

将细胞或组织裂解后收集总蛋白，使用10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳实验，90 V电压下进行120 min。然后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。分别加入相应的一抗（稀释1∶1 000）室温震荡2 h，后在4℃孵育过夜，加入二抗（稀释1∶5 000），孵育3 h。通过Quantity One软件分析条带的灰度值并计算目标蛋白质的表达量。

1.6 CCK-8检测细胞生长

将各组细胞洗涤后制成细胞悬液（2×104/ml），接种于96孔板，每孔100μl，在培养第24 h、48 h和72 h加入10μl CCK-8试剂并在37℃下培养，通过酶标仪450 nm处的光密度计算相对细胞活力。

1.7 Transwell检测细胞侵袭

将转染后的各组细胞（3×104）转移至Transwell小室的上室，底室为10%FBS的完全培养基，孵育48 h后洗去未侵入的细胞。然后将入侵的细胞用20%甲醇固定并用0.2%结晶紫染色。在倒置显微镜高倍镜下随机选择5个视野，检测入侵到底室的并被染为紫色的细胞数目。

1.8荷瘤裸鼠实验

将8只Balb/c裸鼠随机分为2组，即对照组和miR-195-5p组，每组4只。根据1.3的方法制备NC转染的和miR-195-5p mimic转染的SKOV-3细胞系。然后分别将制成0.2 ml的细胞悬液（600万个细胞），皮下注射到Balb/c裸鼠中。当对照组小鼠瘤体生长至约1 000 mm3时处死小鼠，取出瘤体检测肿瘤体积和质量。

1.9统计学分析

所有实验设立3个复孔。数据以平均值±标准差表示。统计分析使用SPSS 19软件。进行单因素方差分析，两两分析使用t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-195-5p靶向STAT3

首先我们通过Starbase预测了miR-195-5p靶向STAT3的结合位点，见图1。然后通过双荧光素酶实验结果验证了同时转染miR-195-5p和STAT3-wt的细胞的荧光酶素活性显著降低（P<0.05），说明miR-195-5p直接靶向STAT3，见图2。

图1网站预测miR-195-5p直接靶向STAT3的结合位点

图2双荧光素酶报告检测miR-195-5p靶向STAT3

2.2各组miR-195-5p和STAT3表达水平比较

Mimic组和mimic+STAT3组的miR-195-5p水平显著高于对照组（P<0.05),STAT3组的STAT3 mRNA和蛋白显著高于对照组（P<0.05），说明转染实验成功。Mimic组的STAT3 mRNA和蛋白的水平显著低于对照作用（P<0.05),mimic+STAT3组的STAT3 mRNA和蛋白的水平显著高于mimic(P<0.05），过表达STAT3可抵消和逆转过表达miR-195-5p对STAT3的抑制作用，见图3。

图3各组SKOV-3细胞中miR-195-5p、STAT3 m RNA和蛋白表的相对达水平比较

2.3各组细胞活力比较

在培养后48 h和72 h,mimic组的细胞活力显著低于对照组（P<0.05),STAT3组的细胞活力显著高于对照组（P<0.05），并且mimic+STAT3组的细胞活力显著高于mimic组（P<0.05），见图4。

图4各组相对细胞活力比较

2.4各组细胞侵袭能力比较

mimic组的细胞侵袭能力显著低于对照组（P<0.05),STAT3组的细胞侵袭能力显著高于对照组（P<0.05），并且mimic+STAT3组的细胞侵袭能力显著高于mimic组（P<0.05），见图5。

图5 Transwell检测各组细胞侵袭能力比较（×200)

2.5各组PD-L1 mRNA和蛋白水平比较

Mimic组的PD-L1 mRNA和蛋白水平显著低于对照组（P<0.05),STAT3组的PD-L1 mRNA和蛋白水平显著高于对照组（P<0.05），并且mimic+STAT3组PD-L1 mRNA和蛋白水平显著高于mimic组（P<0.05），见图6。

图6各组PD-L1 m RNA和蛋白水平比较

2.6各组小鼠肿瘤体积和质量比较

miR-195-5p组荷瘤裸鼠的肿瘤体积和质量均显著低于对照组（P<0.05），见图7和表1。

图7荷瘤裸鼠实验检测miR-195-5p对肿瘤生长的作用

表1各组小鼠肿瘤体积和质量比较

表1各组小鼠肿瘤体积和质量比较

2.7各组miR-195-5p、STAT3和PD-L1蛋白水平比较

miR-195-5p组荷瘤裸鼠的肿瘤组织中STAT3和PD-L1蛋白水平显著低于对照组（P<0.05），见图8和表2。

图8 Western blot检测各组小鼠肿瘤组织中STAT3和PD-L1蛋白水平

表2各组小鼠肿瘤组织中miR-195-5p、STAT3和PD-L1蛋白水平比较

3、讨论

卵巢癌是妇科癌症女性的常见死亡原因，尽管许多早期卵巢癌的新生物标志物被发现，化学疗法、放射疗法、靶向疗法和免疫疗法在治疗广泛应由于卵巢癌的治疗，但由于肿瘤的转移、复发和获得性耐药，卵巢癌的5年总生存率仍然很差。由于缺乏用于早期症状筛查手段的限制，大约75%的妇女在诊断时患有晚期的卵巢癌，这也是引起卵巢癌患者不良预后的主要因素[10]。因此，迫切需要了解潜在的卵巢癌发生、进展的分子机制，以预测肿瘤发生、提高早期的临床诊断，并探索卵巢癌的新治疗策略和靶标。

miRNA的异常表达发生在多种肿瘤中，并且通常与恶性潜能的改变有关，例如肿瘤细胞生长、凋亡、迁移和侵袭能力的改变。MiRNA可通过碱基配对的方式与靶基因mRNA的3’非翻译区相结合，诱导mRNA降解和转录抑制，从而在转录后的水平上调节基因的表达，调节细胞生物学行为[11]。MiR-195-5p是一种新发现的肿瘤相关miRNA，有研究显示miR-195-5p可通过靶向调节PRRR11的表达抑制前列腺癌细胞的增殖能力和管生成能力，从而发挥抑癌作用[12]。在肝细胞癌中，miR-195也可以通过靶向抑制EYA1的表达促进肝癌细胞的恶性侵袭能力，并且miR-195低表达与肝癌患者的不良预后有关[13]。在本次研究中，我们首先通过预测和双荧光素酶报告验证了miR-195-5p可直接靶向STAT3的mRNA，并且过表达miR-195-5p可抑制STAT3mRNA和蛋白的表达水平，而过表达STAT3可抵消和逆转miR-195-5p对STAT3的抑制作用。此外，上调miR-195-5p的水平会抑制卵巢癌细胞的生长和侵袭，而过表达STAT3会促进卵巢癌细胞的生长和侵袭并逆转miR-195-5p对卵巢癌细胞的抑制作用。STAT3是STAT通路中的重要蛋白，并且研究STAT3的过表达与卵巢癌的发生和发展密切相关[14]。并且STAT3的水平会受到miRNA的靶向调节[15]。而本次研究显示了miR-195-5p可能通过靶向抑制STAT3的表达在卵巢癌中发挥抑癌作用。

研究认为STAT3可通过调节PD-L1的水平调节免疫抑制[16]。PD-1和PD-L1是免疫调节轴主要构成部分，可阻断肿瘤微环境中的抗肿瘤效应子反应。PD-1是在几种适应性免疫细胞和先天免疫细胞膜表面表达，如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞，PD-L1是PD-1的配体，可在肿瘤细胞，上皮细胞和内皮细胞上表达，共同调节免疫逃逸，引起肿瘤不受免疫系统监控的恶性增殖[17]。为分析miR-195-5p/STAT3对免疫抑制的影响，我们检测了各组细胞中PD-L1的水平，结果显示mimic组的PD-L1 mRNA和蛋白水平显著低于对照组，STAT3组的PD-L1 mRNA和蛋白水平显著高于对照组，并且mimic+STAT3组PD-L1 mRNA和蛋白水平显著高于mimic组。此外，体内实验结果也显示过表达miR-195-5p会显著抑制荷瘤裸鼠模型中肿瘤的生长，并抑制STAT3和PD-L1蛋白的表达。有研究显示miR-197可通过促进STAT3的水平调节PD-L1的水平，并诱导肺癌细胞的耐药性[18]。Tang等[19]的研究显示PD-L1可受到miR-3127-5p的调节上调，并且这种机制通过STAT3通路实现。这提示miR-195-5p可通过STAT3抑制PD-L1的表达，从而调节免疫抑制反应，发挥抑制肿瘤生长的作用。这提示miR-195-5p能成为临床诊断和治疗卵巢癌的新靶点，抑制miR-195-5p可能通过解除免疫抑制从而帮助提高卵巢癌的预后。此外，也miR-195-5p也具有调控其他基因mRNA降解的作用，并调节STAT3蛋白的表达和磷酸化，从而发挥抑癌作用。因为miRNA-mRNA调节过程较为复杂并形成网络，miR-195-5p也可能通过调控其他蛋白改变STAT3蛋白的功能，从而参与卵巢癌的侵袭和免疫抑制反应。

综上所述，miR-195-5p可通过靶向STAT3抑制PD-L1的表达，从而发挥抑制卵巢癌细胞生长、侵袭和免疫抑制反应，起到抑制卵巢癌生长的作用。但是关于miR-195-5p在卵巢癌中临床意义和与预后的价值得进一步研究，其通过STAT3调节免疫抑制的机制仍需要进一步研究。

参考文献：

[2]郝文斌,相芬芬,刘巧丽.髓源抑制细胞在肿瘤微环境中的研究进展[J].免疫学杂志,2017,33(8):729-732.

陈丽,张静怡,王露玉,孙白云,郭亮生.miR-195-5p通过靶向STAT3调控免疫抑制基因PD-L1参与卵巢癌增殖和侵袭的机制研究[J].免疫学杂志,2020,36(07):572-577.