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增强免疫力功能方面益生菌的作用探究

2020-12-02 966 上传者：管理员

摘要：本试验旨在研究益生菌在增强免疫力功能方面的作用。采用经口灌胃给予方式，设受试物组2组，给予剂量为176mg/kg/d的益生菌液，同时设阴性对照组（生理盐水），对血常规、脾淋巴细胞增殖能力，迟发型变态反应（DTH），腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬百分率及吞噬指数等指标检测，评价益生菌对小鼠免疫功能的影响。结果显示：与阴性对照组相比，小鼠血液白细胞（WBC）数、淋巴细胞（LYMPH）数、嗜酸性粒细胞（EOS）数及淋巴细胞比例（LYMPH%）明显增加（p<0.05或p<0.01）；脾脏淋巴细胞增殖能力显著增加（p<0.01）；但小鼠体重，攻击前后小鼠足跖厚度，小鼠胸腺和脾脏系数、600和680nm处K值和吞噬指数α，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数无明显统计学差异（p>0.05）。综上，该试验条件下的益生菌具有一定的免疫增强功能。

关键词：
免疫力
小鼠
消化系统
益生功能
益生菌
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近年来，随着对益生菌的深入研究，人们逐渐了解到其益生特性，已广泛应用于食品、营养保健、动物养殖等各方面。研究证明，益生菌是一类当达到足够量时对宿主有益的活的微生物，具有预防和治疗多种疾病的功效。包括预防便秘,维持菌群平衡[1]；刺激机体免疫系统成熟,提高机体的免疫防御功能[2]等。其中，增强免疫力可降低动物对疾病的敏感性，且是在非消化系统中发挥的主要作用。

研究表明，不同益生菌具有不同益生功能，且增强机体免疫功能的作用机制不同。可通过调节免疫球蛋白IgA与IgG的分泌,增强机体免疫功能。如李玲茜等指出，与对照组（基础饲料）相比，复合益生菌组蛋雏鸡血清中IgA、IgG含量有显著提高，具有增强免疫功能的作用，同时可调整肠道菌群[3]。另外，益生菌也可通过激活宿主T细胞、NK细胞等来增强机体的免疫[4]。例如，乳酸菌可提高T淋巴细胞增殖能力，产生IL-2、IL-10、IgA、IgG，并提高单核-巨噬细胞吞噬作用，刺激活性氧、溶酶体酶等的分泌作用[5,6]。朱韶娟等人通过研究复合乳酸菌对小鼠免疫功能的影响发现。与对照组相比，益生菌可显著增强NK细胞活性，且小鼠攻击前后足跖厚度和脾淋巴细胞增殖能力均有显著变化，具有增强免疫力的作用[7]。

综上，对益生菌及其对免疫功能影响的研究可为其功能探讨及应用积累数据。但目前针对菌株特异性的研究内容尚不完善，这在一定程度上限制了益生菌制剂的应用。因此，本实验旨在研究该试验条件下的益生菌对增强小鼠免疫功能的影响，为益生菌制剂的合理应用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与饲养管理

选用SPF级BALB/c雌性小鼠80只，4-5周龄（体质量范围17.01-20.05g）；试验期间定量添加SPF级小鼠基础饲料，自由采食。

1.1.2实验样品

益生菌（双歧杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌）。配制：称取适量的益生菌，加入含生理盐水溶液的容器中，持续搅拌，最后加生理盐水定容至所需体积，粘贴标签进行标识。

0.9%氯化钠注射液。

1.1.3主要试剂

细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇、青链霉素、谷氨酰胺、刀豆蛋白A(ConA）；盐酸；异丙醇；MTT;Hank's液；PBS;PEROXSHEAT,PEROX1,PEROX2,PEROX3,RBC,HGB,BASO,autoRETIC,EZWASH,DEFOAMER，鞘液均购自西门子医学诊断产品有限公司；SRBC；印度墨汁；Na2CO3；鸡红细胞；丙酮；甲醇；生理盐水；Giemsa染液。

1.1.4主要仪器与设备

血细胞分析仪、二氧化碳培养箱、超净工作台、酶标仪、显微镜、高压灭菌器、多功能台式高速冷冻离心机、游标卡尺、分光光度计。

1.2方法

1.2.1实验设计

设小鼠脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应实验、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验4个试验，每个试验分为对照组和受试物组，每组小鼠10只，共8组，分组后组间平均体重差异不超过±20%。采用经口灌胃给予受试物法，给予周期30天，每天1次。受试物组给予剂量176mg/kg，对照组和模型组给予20mL/kg生理盐水。各组灌胃体积均为20mL/kgBW，每7天称重2次，根据最近一次动物体重计算给予体积，给予体积按四舍五入保留至小数点后1位数（量程1.00mL注射器，精度0.01mL）。

1.2.2临床症状观察

试验期间，每天观察小鼠1次。观察内容包括营养、皮肤粘膜、精神行为、被毛、头部、呼吸、消化、泌尿生殖等，并记录有无异常。

1.2.3脾淋巴细胞转化实验

1.2.3.1体重测定

分别在给予受试物和生理盐水第6、12、18、24、30天对受试组和对照组小鼠进行称重。

1.2.3.2血常规检测

给予受试物第30天，在给予后1-2小时内称重，眼眶静脉丛采血约300µL，利用血细胞分析仪检测血常规。

1.2.3.3脾细胞悬液制备

无菌取脾称重后，置于有适量（3-5mL）无菌Hank's液平皿中，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。过滤，用Hank's液洗涤，离心10min(1000r/min）。将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，调整细胞浓度为3×106个/mL。

1.2.3.4淋巴细胞增殖能力测定

将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75µlConA液（相当于7.5µg/mL），另一孔作为对照，置5%CO2,37℃培养72h。培养结束前4h，吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液与MTT(5mg/mL)50µl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。加至96孔培养板中，作3个孔的平行样，以570nm波长测定光密度值。结果以淋巴细胞增值能力表示，淋巴细胞增值能力=加ConA的光密度值值–未加ConA的光密度值。若受试组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

1.2.4小鼠迟发型变态反应实验

DTH的产生与测定。第30天给予受试物后1-2小时，小鼠腹腔注射2%(v/v)的绵羊红细胞SRBC0.2mL（约1×108个SRBC）使其致敏。致敏4天后，测定小鼠左后足趾厚度，同时在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC，每只小鼠20µl（约1×108个SRBC），注射24h后测量左足后趾部厚度，测三次，取平均值。结果以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值表示。若受试物组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果为阳性。

1.2.5小鼠碳廓清实验

碳廓清能力测定。第30天给予受试物后1-2小时，称重，小鼠尾静脉注入稀释3-4倍的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。注入后2-10min，从眼眶后静脉丛取血20µL，立即加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度计在600nm和680nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏、脾脏、胸腺称重，计算脾脏和胸腺系数，以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。（a）为吞噬指数α计算公式。若受试物组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果为阳性。

K=(lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）,吞噬指数α=体重/（肝重+脾重）×K1/3(a)

1.2.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

吞噬功能测定。每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL，间隔30min，处死动物，剪开腹壁皮肤，在腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于载玻片上，置于湿盒中，37℃温箱孵育30min后，用生理盐水中漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数。（b）为吞噬百分率和吞噬指数计算公式。若受试物组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，可判定实验结果为阳性。

1.3数据处理和统计学分析

本试验数据以均值±标准差表示，均采用SPSS22.0软件进行独立样本的t检验分析。

2、结果及分析

2.1临床症状

在小鼠给予受试物期间，每天观察营养、被毛、皮肤粘膜、精神行为、惊厥反射、头部、呼吸、消化、泌尿生殖等发现，无明显异常反应。

2.2小鼠脾淋巴细胞转化实验

2.2.1体重变化

结果见表1。与对照组比较，给予受试物益生菌30天内，小鼠体重无明显统计学差异。表明本实验条件下的益生菌对小鼠体重无明显影响。

表1小鼠脾淋巴细胞转化实验⋅体重变化（g)

2.2.2血常规检测

结果见表2。与对照组比较，给予受试物益生菌期间，小鼠血液白细胞（WBC）数、淋巴细胞（LYMPH）数、嗜酸性粒细胞（EOS）数及淋巴细胞比例（LYMPH%）明显增加（p<0.05或p<0.01），而中性粒细胞比例（LYMPH%）和单核细胞比例（MONO%）明显下降（p<0.05或p<0.01），血小板分布宽度（PDW）和平均血小板体积（MPV）明显降低（p<0.05或p<0.01）。上述结果表明，在本试验条件下的益生菌可增加白细胞和淋巴细胞数量。

2.2.3淋巴细胞增殖能力

结果见表3。与对照组比较，给予受试物益生菌30天，脾脏淋巴细胞增殖能力显著增加（p<0.01），表明在本试验条件下的益生菌可具有促进淋巴细胞增殖作用。

2.3小鼠迟发型变态反应实验

与对照组比较，给予受试物益生菌30天，攻击前后小鼠足跖厚度无明显统计学差异（结果见表4）。表明在该试验条件下的益生菌的迟发型变态反应为阴性。

表2小鼠脾淋巴细胞转化实验⋅小鼠血常规变化

注：与对照组比较，*：p<0.05,**:p<0.01

表3小鼠脾淋巴细胞转化实验⋅淋巴细胞增殖能力变化

注：与对照组比较，**：p<0.01

表4小鼠迟发型变态反应实验⋅攻击前后足跖厚度

2.4小鼠碳廓清实验

与对照组比较，给予受试物益生菌30天，小鼠胸腺和脾脏系数、600nm和680nm处K值和吞噬指数α无明显统计学差异（结果见表5）。表明在该试验条件下，益生菌的碳廓清实验为阴性。

表5小鼠碳廓清实验

2.5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

与对照组比较，在给予受试物益生菌期间，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数均无明显统计学差异（结果见表6）。表明在本试验条件下，益生菌的脾淋巴细胞转化试验结果为阴性。

表6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

3、结论

益生菌刺激机体免疫系统成熟的作用机制具有特异性，同时表现出不同的调节效果。本试验通过小鼠灌胃给予176mg/kg益生菌30天，经血常规、小鼠脾淋巴细胞转化实验、小鼠迟发型变态反应实验、小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验评价益生菌是否具有增强免疫力功能。结果显示，与对照组比较，益生菌组血液中白细胞和淋巴细胞数量明显增加，脾脏淋巴细胞增殖能力显著增加，但迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果呈阴性。综上，在本试验条件下，连续灌胃给予176mg/kg益生菌30天，可增加血液中白细胞数和淋巴细胞数，促进脾脏淋巴细胞增值，具有一定的免疫增强功能。

参考文献：

[3]李玲茜,惠俊楠,吴旻,等.海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡生长性能､肠道形态和免疫功能的影响[J].中国畜牧杂志,2020,56(3):88-94.

[4]王博.益生菌､果寡糖对后备母猪生长性能､免疫功能和肠道微生物的影响研究[D].中国农业科学院,2015.

[7]朱韶娟,张立彦.复合乳酸菌粉冲剂增强免疫力作用的研究[J].现代食品科技,2013(1):77-80.

[8]李晓萌,钟伟,徐淼,等.一种复合益生菌制剂对Balb/c小鼠特异性免疫功能的影响[J].食品与发酵科技,2016,53(1):50-52.

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