桑黄是一种十分珍贵的大型药用真菌，隶属担子菌亚门，层菌纲，多也菌目锈革孔菌科[1].桑黄可寄生在阔叶树的树干、立木及枯立木上.根据寄生树种的不同，可分为杨树桑黄、桦树桑黄、桑树桑黄、丁香树暴马桑黄等品种.古医书《药性论》中最早提及“桑黄”名称，书中称其为“桑臣”“桑耳使”,又称桑黄[2].近几年桑黄药用功能不断地被发现，研究[3]表明，其具有提高机体免疫力、抗肿瘤等功效.目前，国际上公认桑黄是抗肿瘤效果最好的真菌之一[4].由于桑黄是一种有效、安全、无毒副作用的药用真菌，受到越来越多的科研工作者关注[5].关于通过S180荷瘤小鼠研究桑黄子实体提取物的抗肿瘤作用国内外尚无相关报道.本试验通过探讨桑黄子提取物EBPI的抗肿瘤作用，阐明其抑瘤潜在的作用机制，可为肿瘤治疗提供新的理论依据.

1、材料与方法

1.1动物、细胞株、药品、试剂及主要仪器

228只清洁级ICR小鼠(动物合格证号：SCXK(吉)2007-0003,吉林大学基础医学院动物中心),6～8周龄，体质量18～23 g,雌雄各半.S180小鼠瘤株(吉林大学基础医学院常规传代培养);白桦桑黄子实体提取物(长春日惠食用菌提供);环磷酰胺(CTX:规格200 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号10070221);吉姆萨染料(Sigma公司，美国);Caspase-3和β-actin抗体(Abcam公司，美国);BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物技术生物技术有限公司);GIS-2020D凝胶图像分析系统(Sigma公司，美国);低速自动平衡离心机(型号LDZ4-1.8,北京雷勃尔离心机有限公司);LDZ5-2型离心机(北京医用离心机厂);超净工作台(型号SW-CJ-1F,苏州安泰空气技术有限公司);BX53正置显微镜(OLYMPUS公司，日本);细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司);酶标仪(Tecan Sunrise公司，瑞士);恒温水浴箱(上海医疗器械股份有限公司设备厂).

1.2 S180荷瘤模型[2]的建立

将已接种于小鼠腹腔7～8 d的S180腹水瘤于无菌条件下抽取腹水，和无菌生理盐水按比例(1∶3)稀释，台盼蓝染色，计数活细胞，检查细胞活性后，在超净工作台上以(1～2)×107个/mL细胞浓度接种于小鼠右腋窝的皮下，0.2 mL/只，30 min内接种完成.

1.3实验动物分组及给药

接种24 h后将小鼠随机分成6组，模型组(蒸馏水，0.1 mL/10 g, 1次/d,灌胃)、环磷酰胺组(30 mg/kg, 0.1 mL/10 g, 1次/d,腹腔注射)、EBPI剂量组(0.5 g/kg、1 g/kg和2 g/kg,蒸馏水配制，0.1 mL/10 g, 1次/d,灌胃)、正常对照组，每组10只小鼠，接种24 h后开始给药，1次/d,连续给药10 d.

1.4脾脏指数、胸腺指数、肝脏指数的测定

使用电子天平，采用称重法称量小鼠体质量及脾脏、胸腺、肝脏(剔除器官的结缔组织与脂肪组织)的质量，并计算脾脏指数、胸腺指数、肝脏指数.其中，脾脏指数=脾脏质量/体质量；胸腺指数=胸腺质量/体质量；肝脏指数=肝脏质量/体质量.

1.5小鼠体外脾淋巴细胞增殖

无菌取脾：采用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠浸泡在75%的乙醇中3 min后，左腹部朝上，放在超净工作台的无菌盘里；剪开左上腹皮肤，暴露脾脏；小剪刀剪下无菌镊子夹住的脾脏，放于D-Hank′s液培养皿中.脾细胞混悬液的制备：将脾脏置于不锈钢网上，放入无菌D-Hank′s液培养皿中，用无菌镊子反复挤压脾脏，单个脾细胞经筛网滤到D-Hank′s液培养皿中，再用离心管将脾细胞混悬液离心3次(4～7 min, 1 500 r/min)[5].取出下层含有脾细胞的液体100μL,用台盼兰染色后计数脾细胞，使其存活率达95%以上；调整脾细胞浓度为5×105/mL后将悬液加到培养板(96孔，每行12个孔，共8行)中，每孔100μL;每组脾细胞分装12个孔中，9个孔加ConA(5μg/mL)100μL,另3孔不加Con A,只加培养液100μL作为对照，每孔总体积200μL,其他7行试验方法同上.于37℃、5%CO2孵箱培养72 h,培养68 h时，每孔加10μL的5 mg/mL MTT液，72 h后弃上清，每孔加150μL DMSO,10 min后，于波长570 nm[5]处测定OD值.转化值=平均OD值(给药组)-平均OD值(对照组)[5].

1.6瘤体重量测定

荷瘤小鼠饲养12 d后统一处死各组小鼠，取出并剥净瘤体，逐一测定瘤体质量，并计算出抑瘤率.抑瘤率=[平均瘤质量(模型组)-平均瘤质量(给药组)]/平均瘤质量(模型组)×100%.

1.7 Western blotting法检测荷瘤小鼠瘤体Caspase-3蛋白的表达

每组随机抽取部分瘤体组织，经匀浆后进行蛋白定量；每组取等量样品进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭过夜(4℃),用0.5% BSA液稀释一抗，与印迹膜在室温下孵育2 h,取出后用TBST洗膜(3次，10 min/次);再用0.5% BSA液稀释二抗，稀释后的二抗与印迹膜在室温下孵育2 h, TBST液洗膜(15 min×3次);ECL显示剂发光，凝胶成像处理系统观察并进行数据分析.

1.8统计学分析

应用SPSS 22.0对数据进行处理与统计学分析.各组小鼠免疫器官指数、瘤体质量、抑瘤率及Caspase-3蛋白表达均以均数±标准差(x¯±s)表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验.P<0.05为差异具有统计学意义.

2、结 果

2.1各组荷瘤小鼠免疫器官指数

本研究结果显示，与对照组比较，CTX组脾指数、胸腺指数和模型组脾指数均下降(P<0.05);与CTX组比较，各剂量EBPI组小鼠脾脏指数、胸腺指数都升高明显(P<0.05或P<0.01);与模型组比较，低和中剂量EBPI组小鼠脾脏指数和胸腺指数均提高(P<0.05),高剂量EBPI组小鼠胸腺指数显著提高(P<0.01),脾脏指数各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较，CTX组小鼠胸腺和脾脏指数有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 EBPI作用后各组S180荷瘤小鼠免疫器官指数

2.2 S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的测定

应用酶标仪测各给药组OD值，结果显示，EBPI各剂量组均可促进S180小鼠脾淋巴细胞的增殖，CTX组和模型组与对照组相比，淋巴细胞增殖均降低(P<0.01),低、中和高剂量EBPI组与CTX组和模型组比较，小鼠脾淋巴细胞增殖升高显著(P<0.05),淋巴细胞的增殖出现剂量依赖性.镜下观察可见各剂量EBPI治疗组淋巴母细胞增殖出现明显分化，而模型组和CTX组淋巴细胞分化较少，且在CTX组无淋巴母细胞生成.见表2、图1.

表2 EBPI对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的测定

图1显微镜观察台盼兰染色S180荷瘤小鼠脾 淋巴细胞增殖(200×)  

2.3各组S180荷瘤小鼠瘤体质量及抑瘤率

本研究结果显示，与模型组比较，低、中和高剂量EBPI组小鼠瘤体质量及抑瘤率差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);中、高剂量EBPI组瘤体质量和抑瘤率明显低于CTX组(P<0.05).见表3、图2.

表3各组S180荷瘤小鼠瘤体质量及抑瘤率

图2称重法检测S180荷瘤小鼠瘤体质量(n=8,x¯±s)  

2.4 Western blotting法检测荷瘤小鼠瘤体Caspase-3蛋白的表达

Western blotting法检测结果显示：低、中和高剂量EBPI组Caspase-3蛋白的表达较对照组明显增加(P<0.05),且Caspase-3蛋白的表达量与EBPI浓度呈正相关关系.见图3.

图3 Western blotting法检测荷瘤小鼠瘤体Caspase-3蛋白的表达  

3、讨 论

桑黄是一种珍贵且稀少的药用真菌，《本草纲目》[6]中最早记录其药用功能，可用于腹胀、腹泻、胃痛、淋巴结肿大、鼻出血、子宫出血等疾病的治疗[7],被誉为“森林黄金”[8].《神农本草经》记录桑黄具有延年益寿的功效[9].随着对桑黄研究的不断进展，发现其还具有抗肿瘤和增强免疫力的作用[10].本研究所用白桦树桑黄是桑黄品种中的一种[11].

接种S180后荷瘤小鼠免疫功能检测结果显示：模型组和CTX组较EBPI组小鼠脾脏和胸腺指数明显降低，提示荷瘤小鼠免疫功能有所降低(P<0.05).与模型组和CTX组相比，各剂量EBPI组小鼠脾脏、胸腺指数均显著提高(P<0.05).由于药物作用时间较短，致各药物组小鼠肝脏指数均无明显变化.

本课题组前期试验[12]证实，EBPI各剂量组可显著升高荷瘤小鼠血清中的IL-2、TNF-α水平(P<0.05);为进一步明确EBPI是否能提高S180荷瘤小鼠的免疫功能，本研究探讨了EBPI对S180荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响.淋巴细胞在受到特异性抗原[13]或非特异性的有丝分裂原(如ConA)刺激后细胞体积增大，逐渐转化分裂成为淋巴母细胞，通过淋巴细胞转化率能够体现机体细胞免疫水平.因此，淋巴细胞转化率可用于评定机体免疫功能指标[14,15,16].在ConA作用下，T淋巴细胞可出现与体内活化相似的分化与增殖.因此，试验中评价淋巴细胞功能常用ConA诱导淋巴细胞增殖来衡量[17].本研究显示，EBPI可通过促进ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖，致荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的数量显著升高，增强免疫细胞对外来特异性抗原免疫应答能力，从而提高对肿瘤细胞的清除能力，这表明EBPI具有增强机体免疫细胞活性的作用.

Caspase家族是一组在细胞凋亡中起重要作用的特异性蛋白酶.正常情况下，Caspases存于细胞胞质中，是无活性的.当凋亡刺激信号作用于细胞后，Caspases被活化，成为有活性的功能体.Caspase-3是Caspase家族中的一员，可裂解胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡.本研究初步探讨了EBPI对Caspase-3蛋白表达的影响，结果提示，EBPI可显著增加Caspase-3蛋白表达、诱导细胞凋亡、抑制S180荷瘤小鼠瘤体的生长.

本研究初步探讨了EBPI在抑制肿瘤生长中的作用及机制.结果显示，EBPI能抑制多种肿瘤细胞生长，延长荷瘤小鼠存活时间，提高荷瘤小鼠的生活质量，促进Caspase-3蛋白表达.EBPI抑制肿瘤生长的机制可能是通过提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数、促进脾脏淋巴细胞的增殖，达到通过提高机体的免疫力、促进Caspase-3蛋白表达、诱导细胞凋亡等发挥抑瘤的作用.若在临床上治疗肿瘤的过程中配合使用EBPI,可使放化疗的毒副作用减轻，获得满意的治疗效果.

本研究表明，桑黄具有增强荷瘤小鼠免疫功能作用，可能通过提高小鼠脾脏和胸腺指数[18]促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的分化与增殖[19],进而提高荷瘤小鼠机体的免疫力，促进Caspase-3蛋白表达发挥抗肿瘤作用.研究[20,21]还证实，机体免疫功能失衡与肿瘤发生、发展的进程密切相关，提高肿瘤患者自身免疫功能或许是免疫治疗的关键[22].因此，本研究可为肿瘤防治提供科学的理论依据.

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基金资助:吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20220067KJ,JJKH20220068KJ,JJKH20210057KJ);吉林省卫生健康技术创新项目(2019J051);北华大学博士启动基金资助课题(199500033);国家级大学生创新创业训练项目(202210201039,202310201037,202310201103,202310201040);

文章来源:王立英,鞠明,刘絮等.桑黄子提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2023,24(06):749-753.