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IL-17A预处理脂肪来源间充质干细胞调节淋巴细胞功能

2024-03-29 110 上传者：管理员

摘要：为探讨IL-17A增强脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)对外周血淋巴细胞的免疫调节作用及机制，收集天津市人民医院4例腹部外科术后留取的患者皮下脂肪组织和外周血，分离、培养、鉴定ADSC并将其分为IL-17A预处理(ADSC-17组)及未处理(ADSC组)2组，分别与外周血淋巴细胞在植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)+IL-2刺激条件下共培养。MTT法检测活化淋巴细胞的增殖抑制率；FACS检测CD4+CD25+ T淋巴细胞百分比；ELISA检测培养上清液TGF-β1含量。结果显示，分离培养的ADSC与ADSC-17组均高表达分化群(cluster of differentiation, CD)90、CD105和CD73,均具有分化为成骨及成脂细胞的能力。与ADSC组比较，ADSC-17组显著提高活化淋巴细胞的增殖抑制率(均P<0.01),呈剂量依赖关系。ADSC-17组CD4+CD25+T淋巴细胞百分比及培养上清液TGF-β1含量相比ADSC组均显著升高(均P<0.05)。由此，IL-17A预处理可增强ADSC抑制淋巴细胞增殖及诱导CD4+CD25+T淋巴细胞分化的能力，是诱导淋巴细胞低反应性的有效策略。

关键词：
免疫调节
白细胞介素17A
脂肪组织
血液系统疾病
间充质干细胞移植
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间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)疗法是当今医学界极热门的研究方向之一，目前在包括血液系统疾病、急慢性肺部疾病、心脏病、糖尿病、帕金森病、神经损害、类风湿关节炎和器官移植等多个疾病领域，都已取得一系列令人振奋的研究成果[1,2]。近期研究表明，在高水平促炎细胞因子刺激后，MSC可分泌多种趋化因子、免疫调节分子和生长因子，可趋化到炎症活动性部位发挥免疫调节和促进组织再生修复[3]。我们前期也报道了IFN-γ预处理增强脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)的免疫抑制特性[4],但尚不清楚参与炎症反应的其他促炎因子预处理是否增强ADSC的免疫调节作用。IL-17A是免疫应答过程中主要由Th17分泌的关键促炎因子之一，其在感染、炎症和自身免疫反应中发挥重要的促炎功能[5]。本研究旨在观察自体ADSC经IL-17A预处理对活化淋巴细胞的免疫调节作用，从而为诱导淋巴细胞低反应性提供实验依据。

1、材料与方法

1. 1临床资料

收集天津市人民医院行阑尾炎切除术的患者4例，年龄20～40岁，男女各2例，术中获取其腹部皮下脂肪组织并留取外周血10 mL。捐献者均签署知情同意书。

1. 2试剂及仪器

鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD34、CD45和HLA-DR单克隆抗体，小鼠抗人CD4-PerCP-Cy5.5及小鼠抗人CD25-PE荧光抗体，均购自BD Pharmingen公司；DMEM/F12培养液和FBS,均购自Gibco公司； Ⅰ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)、成脂及成骨诱导试剂，均购自Sigma-Aldrich公司；重组人IL-17A和TRIzol RNA提取试剂，均购自Invitrogen公司；重组人IL-2,购自北京四环生物制药有限公司；MTT试剂盒，购自艾博抗(上海)贸易有限公司；聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；TGF-β1 ELISA检测试剂盒，购自R&D公司。倒置相差显微镜，来自奥林巴斯(中国)有限公司；CO2培养箱，来自赛默飞世尔科技公司；超净工作台，来自力康生物医疗科技控股有限公司；FACS Calibur流式细胞仪，来自BD公司；PCR扩增仪，来自美国应用生物系统公司；酶标仪，来自美国伯腾仪器有限公司。

1. 3方法

1.3.1 ADSC的分离、培养和鉴定

按参考文献[6]分离、培养腹部皮下脂肪组织来源ADSC,取第3代ADSC经胰蛋白酶消化后，应用FACS鉴定细胞表面标志物CD90、CD105、CD73、CD14、CD34、CD45及HLA-DR,其中细胞表面标志物表达>95%为阳性，<1%为阴性[7,8]。按参考文献[6]评估体外诱导ADSC多向分化的潜能，光学显微镜下观察茜素红染色后成骨细胞内矿物质的沉积情况及油红O染色后脂肪细胞胞质内球形脂滴的形成情况。

1.3.2实时RT-PCR检测成骨特异性基因骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferatoractivated receptorγ,PPAR-γ)mRNA的相对表达水平

采用TRIzol法提取细胞总RNA,反转录为cDNA。PCR反应条件：95℃预变性10 min; 95℃变性30 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸30 s,共40个循环。记录Ct值，以2-ΔΔCt值表示OPN及PPAR-γ的mRNA相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH[6]。

1.3.3 MTT法检测ADSC对自体淋巴细胞增殖的影响

取第3代ADSC,实验分为2组，一组添加50 ng/mL IL-17A孵育48 h, PBS漂洗3次后作为IL-17A预处理组(ADSC-17组);一组未经IL-17A孵育作为未处理组(ADSC组)。分别调整2组细胞密度至2×104个/mL、1×104个/mL和2×103个/mL,分别接种于96孔细胞培养板，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育6 h。留取的10 mL外周血经淋巴细胞分离液处理离心分离PBMC,并经尼龙毛柱法分离获得淋巴细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL。ADSC与淋巴细胞分别按1〯5、1〯10和1〯50的比例建立共培养体系，向共培养体系中添加10 μg/mL PHA及100 U/mL IL-2刺激淋巴细胞增殖，于37℃、5% CO2培养箱中孵育5 d。另设一对照组为单纯采用PHA及IL-2处理的淋巴细胞。采用MTT法测定反映淋巴细胞增殖情况的光密度[D(570 nm)]值，并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(1-D实验组/D对照组)×100%。

1.3.4 FACS检测CD4+CD25+T淋巴细胞百分比

调整ADSC-17组及ADSC组细胞密度至1×105个/mL,接种于12孔细胞培养板，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育6 h。添加1×106个/mL淋巴细胞建立共培养体系，向共培养体系中添加10μg/mL PHA及100 U/mL IL-2刺激淋巴细胞增殖，于37℃、5% CO2培养箱中孵育5 d。收集细胞培养板中的悬浮细胞，以450×g离心5 min,收集培养上清液，于-80℃冻存。PBS重悬细胞，添加抗CD4、CD25单抗，振荡混匀后室温避光孵育20 min; PBS漂洗、离心重悬细胞后，于流式细胞仪上机检测各组CD4+CD25+ T淋巴细胞百分比。

1.3.5 ELISA检测各组细胞培养上清液TGF-β1的含量

本研究采用ELISA检测各组细胞培养上清液中TGF-β1含量。

1.4统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。定量资料以

表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。检验水准(α)为0.05。

2、结果

2. 1 ADSC的体外鉴定

ADSC及ADSC-17组ADSC表面标志物CD90、CD105和CD73表达均>95%,组间差异无统计学意义(均P>0.05); CD14、CD34、CD45及HLA-DR表达均呈阴性。详见表1、图1。

表1 ADSC及ADSC-17组细胞表面标志物表达的比较(%)

2. 2 ADSC的多向诱导分化潜能

ADSC与ADSC-17组被诱导分化为成骨及成脂细胞的情况见图2。ADSC-17组OPN、PPAR-γmRNA的相对表达水平与ADSC组相比差异无统计学意义(均P>0.05,表2)。

图1 ADSC及ADSC-17组细胞表面标志物的FACS分析

图2 ADSC与ADSC-17组受诱导分化为成骨及成脂细胞的情况(×200)

表2 ADSC及ADSC-17组细胞OPN、PPAR-γmRNA的相对表达量比较(%)

2. 3 ADSC对活化淋巴细胞增殖的影响

ADSC与淋巴细胞共培养结果显示，ADSC组对活化淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，通过比较不同比例ADSC与淋巴细胞共培养结果发现，随着ADSC∶淋巴细胞比值增加，淋巴细胞的增殖抑制率逐渐升高，呈剂量依赖关系(n=4, FADSC=100.794, P<0.01); ADSC-17组对活化淋巴细胞的增殖抑制作用更强，呈剂量依赖关系(n=4, FADSC-17=47.468,P<0.01); ADSC-17组中，各比例共培养体系淋巴细胞的增殖抑制率均高于ADSC组(t值分别为10.428、5.259和3.370,均P<0.01)。详见图3。

图3不同组别ADSC作用下淋巴细胞的增殖抑制率比较

2.4 ADSC对活化淋巴细胞中CD4+CD25+T淋巴细胞百分比的影响

FACS检测结果显示，ADSC组能够显著增加共培养体系中CD4+CD25+ T淋巴细胞的百分比[(18.80±1.79)%],与对照组[(3.75±1.01)%]相比差异有统计学意义(t=14.647, P<0.01); ADSC-17组共培养体系中CD4+CD25+ T淋巴细胞百分比[(23.00±2.92)%]较ADSC组进一步显著升高(t=2.455, P<0.05)。详见图4。

图4 CD4+CD25+T淋巴细胞百分比FACS分析结果

2.5不同组别细胞培养上清液中TGF-β1含量的比较

ADSC-17组培养上清液TGF-β1含量较ADSC组显著升高(t=4.795, P<0.05,图5)。

图5 ADSC及ADSC-17组细胞培养上清液中TGF-β1含量的比较

3、讨论

近十年来，MSC已经成为细胞疗法研究最深入的干细胞类型，在许多疾病的治疗中有巨大的应用前景[7,9]7,9]。现已证实，炎症微环境(炎症信号、促炎因子)刺激对于增强MSC的免疫抑制特性及治疗有效性必不可少[10,11]10-11]。IL-17A是IL-17家族中第一个被发现的成员，在传染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病及促肿瘤生长中发挥强大的促炎功能[12]12]。本研究首先尝试通过测定MSC表面标志、标志基因表达及细胞染色分析IL-17A预处理能否影响ADSC的正常生物学特性。结果显示，IL-17A预处理前后ADSC均高表达MSC表面标志CD90、CD105和CD73,且不表达造血细胞和内皮细胞标志物CD14、CD34、CD45和HLA-DR;两组细胞间茜素红及油红O染色阳性细胞数量相当，骨结节形成特异性基因OPN及脂肪形成特异性基因PPAR-γ的mRNA相对表达水平差异无统计学意义。上述结果表明经IL-17A预处理的人源ADSC显示出正常的生物学特性，例如细胞表面标记、低免疫原性表型和多向分化潜能。

国内外研究均已证实，ADSC主要通过细胞直接接触及旁分泌方式作用于免疫细胞发挥免疫调节及抗炎作用，实现疗效[13,14]13-14]。在体外，MSC免疫调节活性的标志之一是抑制由促有丝分裂因子(如PHA或抗CD3/CD28抗体)诱导的淋巴细胞增殖。已有研究显示脐带间充质干细胞与淋巴细胞共培养可抑制健康成人及SLE患者T细胞增殖[15]15]。故本研究通过MTT法测定了淋巴细胞的增殖抑制率，与先前的观察结果一致，我们的数据表明一旦淋巴细胞活化，ADSC呈剂量依赖性对自体淋巴细胞增殖发挥抑制作用。此外，本研究进一步证实了ADSC-17组对淋巴细胞的增殖抑制作用更加明显，各比例共培养体系中淋巴细胞的增殖抑制率均高于ADSC组，因此IL-17A增强ADSC诱导活化淋巴细胞的低反应性。

ADSC免疫负调节不仅与抑制活化淋巴细胞的增殖有关，事实上，MSC的另一个重要免疫调节功能涉及其影响体内外Th亚群分化[16]16]。相关研究显示，MSC分泌的可溶性免疫抑制因子TGF-β1是诱导Th1、Th17占主导向免疫抑制性Treg偏移的关键因素，有助于T细胞的抑炎转换[17,18]17-18]。有研究报道在缺血再灌注诱导的急性肾损伤(ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury, IRI-AKI)小鼠模型中，脾脏细胞与IL-17预处理的MSC(MSC-17)共培养减少T细胞增殖并增加Treg百分比[19]19]; Ma等[20]20]在皮肤移植模型中也有相似研究结果，突出了MSC-17通过促进Treg增殖诱导异体皮肤移植后免疫耐受，最终延长移植皮瓣的存活时间。因此，本研究通过测定共培养体系中TGF-β1含量及CD4+CD25+T淋巴细胞亚群比例，以进一步考察ADSC的负性免疫调节作用。结果显示，与ADSC组比较，ADSC-17组能够进一步增加TGF-β1含量及CD4+CD25+T淋巴细胞亚群比例，表明在早期炎症微环境下，ADSC通过旁分泌TGF-β1促进CD4+CD25+T淋巴细胞扩增，且增殖的CD4+CD25+T淋巴细胞分泌TGF-β1进一步正反馈促进CD4+CD25+T淋巴细胞的增殖，从而放大ADSC的负性免疫调节效应，在抑制活化淋巴细胞的增殖中起重要作用[21,22]21-22]。

综上所述，IL-17A预处理对于增强ADSC抑制淋巴细胞增殖，诱导Th向CD4+CD25+T淋巴细胞分化具有明显的促进作用，是诱导淋巴细胞低反应性的有效策略。实验结果支持ADSC预处理在未来临床疾病治疗中的潜在用途，有待深入研究。

参考文献:

[4]王平,顾昕,张娜,等.IFN-γ增强脂肪间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用[J].天津医药,2016,44(6):683-686.

[6]杜鹏,王峰,陈晓波,等.年龄对人脂肪来源间充质干细胞生物学特性的影响[J].天津医药,2022,50(9):912-916.

[7]黄志伟,刘涛,陈晓波,等.OX40 Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究[J].天津医药,2021,49(10):1009-1013.

[8]张郭,汪振星,孙家明.人脂肪来源干细胞的免疫调控及其临床应用[J].现代免疫学,2022,42(5):427-433;440.

[15]叶青,杜卫星,陶洪,等.脐带间充质干细胞体外调节SLE患者淋巴细胞亚群功能的相关研究[J].现代免疫学,2020,40(4):306-310;315.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(32170762);

文章来源:龙艺尹,李长林,杜鹏等.IL-17A预处理脂肪来源间充质干细胞调节淋巴细胞功能[J].现代免疫学,2024,44(02):121-125+133.