异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗造血系统恶性肿瘤和部分非恶性肿瘤的一种有效方式，而移植物抗宿主病（GVHD）是患者死亡的重要原因之一。美国国立卫生院（NIH)2005年和2014年的慢性GVHD(c GVHD）共识项目提出了诊断c GVHD及其严重程度的标准，c GVHD不再单纯根据GVHD发生时间（100 d后）诊断，而是根据患者的临床表现进行诊断，受累器官系统严重程度分型。c GVHD的临床表现类似于自身免疫性疾病，常影响一个或多个系统，主要累及皮肤黏膜、肌筋膜和肺，表现为硬皮病、闭塞性细支气管炎、苔藓样口腔黏膜病变等。c GVHD不仅引起患者功能障碍，还降低患者生活质量，给患者增添心理压力和经济压力。

与a GVHD不同，c GVHD的潜在发病机制尚不清楚，但是被认为是复杂的、多因素的。cGVHD的发病过程分为3个阶段，它们通常是连续性发生，但是也可以同时存在、共同致病。c GVHD发生时首先通过细胞毒性化疗、感染、既往a GVHD等因素，触发宿主体内固有免疫，诱导炎症因子释放，导致内皮细胞损伤和血小板活化增加；其次，钙调磷酸酶抑制剂暴露、化疗、免疫球蛋白沉积等因素使胸腺功能受损，调节性免疫细胞募集失调，导致有害的T细胞和B细胞出现，自身效应细胞级联反应不能抵消外周耐受机制，致使慢性炎症产生；最后巨噬细胞活化产生血小板衍生生长因子α和转化生长因子-β(TGF-β），激活成纤维细胞，后者产生过量的细胞外基质堆积在靶器官上，造成硬化。未发生c GVHD的移植患者，在初始内皮细胞损伤时会招募免疫细胞到损伤处修复；而发生c GVHD的移植患者，因为存在同种异体和自身反应性，这个修复过程不会得到严格的控制[1]。c GVHD的3个阶段均涉及免疫反应，前两个阶段分别是固有免疫和适应性免疫，第三阶段既有固有免疫又有适应性免疫。因此，以下将从固有免疫和适应性免疫角度阐述c GVHD的发病机制。

糖皮质激素是c GVHD的一线标准治疗药物，可以单独使用，也可以与其他免疫抑制剂（如钙调磷酸酶抑制剂）联合使用。但是这种治疗方案并非对所有c GVHD患者有效，近50%-60%的患者需要在2年内进行二线治疗。c GVHD严重影响了患者移植后疗效和生活质量，因此其治疗目标是改善患者症状，预防疾病进展、炎症活动、纤维化和残疾发生，延长药物作用时间以停用免疫抑制剂，修复、调节免疫系统，最终改善c GVHD患者生活质量、降低死亡率[2]。为了实现该目标，研发新型治疗c GVHD药物的重心已经从使用广泛的免疫抑制剂转向研究靶向与疾病病理生理学相关途径的免疫调节剂。

固有免疫与cGVHD的关系

1、免疫屏障与中性粒细胞

机体的第一道免疫防线是皮肤和黏膜，移植过程中的放疗、化疗、感染、既往a GVHD都可导致皮肤和黏膜损伤。中性粒细胞是人类血液中最丰富的白细胞，是固有免疫抵御感染的第一道防线，能够分泌高水平的杀菌活性氧防御素和蛋白水解酶，在正常情况下处于稳态，当机体受到创伤或感染时会进一步增加。研究表明，c GVHD患者体内循环低密度中性粒细胞数目显著增加，以未成熟的CD10-为主，可促进自体T细胞增殖及白介素（IL)-6、干扰素γ(IFN-γ）产生[3]。其中IL-6会激活JAK2/STAT3通路，调节Th1和Th17分化。

自然杀伤细胞

自然杀伤（NK）细胞在HSCT之后主要发挥移植物抗白血病/肿瘤作用，并介导病原体特异性免疫。NK细胞根据CD56表达强度分成CD56briCD16dim和CD56dimCD16bri两个亚群，前者主要通过分泌细胞因子发挥免疫调节功能，后者以杀伤功能为主。CD56briCD16dimNK细胞主要分布在HSCT后的早期，其数目减少与GVHD的发生有关，CD56dimCD16briNK细胞较晚才出现[4,5]。CD56briCD16dimNK细胞可分泌细胞因子如IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IL-5、IL-10和IL-13等。小剂量IL-2可扩增CD56briCD16dimNK细胞，通过保留细胞周期抑制剂P21导致效应T细胞接触依赖性细胞周期阻滞[5]。

抗原提呈细胞

抗原提呈细胞包括单核细胞、巨噬细胞以及树突状细胞（dendritic cell,DC）等。单核细胞是一类异质性和功能高度可塑的细胞群，在炎症的启动及其消退和愈合中起重要作用。约80%单核细胞表达CD14++CD16-免疫亚型，主要作用是吞噬和启动炎症，其余20%表达CD14++CD16+和CD14+CD16++免疫表型，前者主要发挥炎症效应，后者主要在抗炎和伤口愈合中起作用。研究发现，特定的器官受累与不同的单核细胞亚群有关，如关节/筋膜受累与CD14+CD16++亚群的百分比低有关，CD14++CD16-亚群与较高的NIH整体严重程度评分和口腔c GVHD相关等[6]。

巨噬细胞是一种先天免疫细胞，几乎存在于所有组织，在维持微环境稳态、修复组织损伤以及固有免疫和适应性免疫等方面都表现出巨大的功能多样性。在allo-HSCT后，组织驻留巨噬细胞（MΦ巨噬细胞）被供体单核细胞衍生的巨噬细胞（M2巨噬细胞）取代，表达CD206，不表达i NOS。M2巨噬细胞不仅可以产生促纤维化因子TGF-β激活成纤维细胞，诱导成纤维细胞分化为产生胶原蛋白的肌成纤维蛋白，促进c GVHD的胶原蛋白合成和沉积[7]；还可以和T细胞相互作用一起影响c GVHD的发生。在小鼠模型中可见，抑制供体巨噬细胞在组织和器官中的浸润，可以改善小鼠c GVHD的情况[8]。

DC是人体主要的抗原提呈细胞，能有效激活外周初始T细胞（Naïve T cell,TN），根据不同分类方式可分为CD4 DC和CD8 DC，经典DC和浆细胞样DC，其中CD8 DC和浆细胞样DC均有助于滤泡辅助T细胞（Tfh）的启动以及自身抗体反应[9]。在c GVHD患者体内，总DC数目减少，但在100 d后，浆细胞样DC数目增加[10]。在HSCT早期，宿主来源的DC会迅速消除，供体来源的DC占主导地位，并提呈供体和宿主抗原激活供体T细胞促进c GVHD的发展。DC不仅可通过抑制性信号分子PD-L1、CD80/86与T细胞表面PD-1、CTLA4相互作用诱导外周T细胞耐受，还可通过扩增调节性T细胞(Treg)来促进供体T细胞的耐受性。但在c GVHD期间，以TNF为主的炎性因子会损害MHCII类抗原递呈途径，使Treg细胞发育失败，从而导致免疫耐受性丧失[8]。Treg细胞在控制致病性T细胞反应中发挥重要作用，其发育障碍可能导致各种自身免疫性疾病的发生。

适应性免疫与cGVHD的关系

2、T细胞与调节性T细胞

c GVHD的主要发病过程是T细胞和B细胞串扰导致生发中心（germinal center,GC）增殖，从而产生同种异体反应性抗体[11]。胸腺损伤后功能障碍可导致Treg细胞生成障碍和阴性选择缺陷，T细胞逃逸到外周组织中[12]。当TN细胞在MHC分子存在的特定细胞因子环境下被抗原刺激时，T细胞开始分化，它们在相对应的信号通路下发育成不同的T细胞亚群，获得特定的效应细胞表型。这些T细胞亚群的特点是产生标志性细胞因子和表达特定的转录因子，被STAT家族成员激活，赋予特定的功能[13]。

与a GVHD发病机制主要围绕Th1细胞不同，c GVHD发病机制主要由Th1细胞和Th17细胞共同介导。过去认为经过化疗、放疗、全身照射等移植前调理，宿主T细胞被消灭，但是新的研究发现宿主T细胞即便在高强度调理处理下，仍有很强的抵抗力[14]。TN、Th1/Tc1、Th17/Tc17、Th22、Tfh、组织驻留记忆T(tissue-resident memory T,Trm）细胞均会诱导c GVHD的发生。TN细胞是CD45RA+CD62L+抗原缺乏的T细胞，具有不同的T细胞抗原受体库。研究表明，TN细胞会诱导c GVHD的发生，同种异体移植物中TN细胞耗竭可以降低严重a GVHD和c GVHD的发病率[15]。在小鼠模型中，供体Th1/Tc1已被证明能诱导GVHD的发生，供体Th1细胞分泌的IFN-γ既能促进Th1分化，又能直接损害肠黏膜。Th1/Tc1细胞的转录因子是T-bet，靶向T-bet可以阻断其分化从而缓解c GVHD[16]。Th17细胞在c GVHD患者血液中明显增加，细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-23指导Th17细胞分化，Th17细胞表达促炎因子IL-17，不表达IL-4、IFN-γ[13]。Th17/Tc17细胞与固有免疫密切相关，迁移至靶器官分泌IL-17，后者可能趋化Ly6Clo单核细胞；部分来源Th17/Tc17细胞的集落刺激因子-1促进Ly6Clo单核细胞分化成MΦ巨噬细胞；在Th17/Tc17细胞产生的多种促炎因子（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IL-22、IL-13）作用下，MΦ巨噬细胞还可以向M2巨噬细胞极化。不同于Th1和Th17细胞在c GVHD发病过程中相对明确的作用，Th22细胞及其细胞因子IL-22的作用仍存在争议。IL-22作用取决于其来源和供体IL-22的位置，如受体缺乏IL-22导致肠道发生更明显的损伤，而供体IL-22的缺乏导致a GVHD严重程度降低。值得注意的是，最新研究发现IL-22的组织保护功能可以通过基于结构的设计与促炎作用解耦[17]。Tfh细胞的分化是一个多步骤的过程，由初始CD4+细胞启动的DC引发，在次级淋巴器官中扩增，分泌细胞因子IL-21，而IL-2抑制Tfh通路[12]。Tfh细胞表达的PD-1与B细胞表达的PD-L2相互作用在GC中T-B细胞相互作用期间十分重要，但在滤泡外作用机制尚不清楚[18]。值得注意的是在c GVHD患者血液中与Tfh细胞功能相同的循环Tfh细胞数目小于健康供体，它的降低原因仍需进一步研究[19,20]。IL-21促进c GVHD的发生，导致GC增殖、B细胞及浆细胞分化以及c GVHD特有的自身抗体出现[13]。过去认为，T细胞只在血液和二级淋巴器官中稳定存在，近来发现大多数记忆T细胞存在于外周组织，如皮肤、肠道、肺部等。在allo-HSCT之前或之后的患者皮肤损伤组织中均发现Trm细胞，与血液中的T细胞相比，这些细胞表现出不一样的转录组程序，转录因子RUNX3和半乳糖凝聚素-3是这些细胞的表型特征[21]。一些宿主来源的Trm细胞具有很强的增殖性，可由供体来源的单核细胞激活，这些Trm细胞通过产生促炎因子（IFN-γ、IL-17）促进GVHD的发展。

Th2、Th9、Treg、NKT等细胞可以调节c GVHD的发生[13]。Th2细胞的主要转录因子是GATA结合蛋白3，可分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等。在动物模型中得知产生IL-10的Th2亚群与GVHD的减少有关。肠道是c GVHD最危险的部位，Th2细胞对肠道的天然保护作用有利于预防严重的肠道c GVHD。Th9细胞是Th2细胞特有的CD4+细胞亚群，产生IL-9和少量IL-4。Th9细胞可通过降低IFN-γ和表达膜结合ST2（即IL-33受体）降低c GVHD的发生，在添加IL-33的条件下会表现出更强的抗GVHD作用，但IL-33/ST2信号通路在c GVHD中的作用仍在研究中[13]。Treg细胞可以诱导免疫耐受，但在c GVHD患者体内Treg细胞数减少、异质性降低[22]。Treg细胞可分泌干扰素和颗粒酶B直接杀死效应T细胞，还可分泌抑制性细胞因子如IL-10、IL-35、TGF-β等来发挥功能，其中IL-10会干扰DC的激活和抗原呈递。在小鼠模型中可见Treg细胞与DC的结合作用力大于Treg细胞与Th细胞，可以阻止后二者的后续相互作用，所以前二者的相互作用处于Treg细胞介导免疫抑制的核心位置[23]。Treg细胞过继治疗可有效抑制c GVHD，但该策略受到宿主外周血中Treg细胞数少的阻碍。Hirai等[24]发现在GVHD小鼠模型中，α-半乳糖神经酰胺通过激活不变NKT细胞增强Treg细胞在体内的增殖，抑制小鼠GVHD的发生。

3、B细胞与调节性B细胞

B细胞耐受性的丧失是c GVHD发展的另一个潜在重要因素。B细胞的异常分为以下几种情况：异常的B细胞信号通路、B细胞亚群改变、调节性B细胞异常、自身免疫。

在c GVHD患者的外周血中，B细胞持续性激活，体积增大，对细胞凋亡具有抗性并且代谢增强。研究表明，活动性c GVHD患者的B细胞活化因子（B cell activating factor of the TNF family,BAFF）增高是异常B细胞信号传导和自身反应性B细胞形成的原因之一。随着BAFF信号通路的增加，c GVHD患者对B细胞抗原受体（B-cell receptor,BCR）刺激的增殖反应增强，随后近端BCR信号分子水平增高，如脾酪氨酸激酶和B细胞连接蛋白，两者被核因子κB和细胞外调节蛋白激酶信号通路刺激磷酸化，最终促进自身反应性B细胞的存活和成熟[25]。除了BAFF和BCR通路，目前研究还发现神经源性基因座缺口同源蛋白2通路在c GVHD中也起作用，可增加BCR对同种抗原的反应性。

c GVHD患者体内出现异常供体B细胞亚群，导致这一现象出现的原因是相对B淋巴细胞减少和持续高BAFF水平。Kolupaev等[26]在c GVHD的闭塞性毛细支气管炎综合征小鼠模型的骨髓中发现淋巴系祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞减少，这与异常的B细胞祖细胞生态位破坏B细胞发育有关。前GC B细胞（Ig D+CD38hiCD27+）和GC后“浆母细胞样”细胞（Ig DloCD38hiCD27+）以依赖BAFF的方式进行增殖。细胞表面表达CD27表示该细胞遇到过抗原，但研究发现来自c GVHD患者的CD27+B细胞可以在没有BCR或二次信号刺激下产生抗体，因此，怀疑它们是非依赖抗原方式介导抗宿主[27]。活动性c GVHD患者体内未成熟/过渡CD21-B细胞增加和CD27+记忆B细胞减少，在之后发现CD19+CD21lo过渡B细胞可以作为cGVHD诊断的生物标志物[28]。

调节性B细胞是一个可下调固有免疫、适应性免疫、炎症等的特殊B细胞亚群。在健康个体中，调节性B细胞可以减少活化CD4+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ，增加分泌IL-10，促进Treg细胞的功能。allo-HSCT后，与非c GVHD患者相比，活动性c GVHD患者调节性B细胞子集，如CD19+Ig M+CD27+记忆B细胞和CD24hiCD38hi过渡B细胞，数量减少且产生IL-10的能力减弱[6]。

自身免疫性疾病与c GVHD的临床表现和实验室结果相似，如BCR信号增强，调节性B细胞功能降低，在许多研究中都评估了后者与自身免疫的相关性。目前，已发现H-Y（女性供者淋巴细胞识别男性受者Y染色体编码的蛋白）自身抗体和PDGFR自身抗体与移植后早期c GVHD的发生有关[28]。近年研究还发现抗Ro52自身抗体与c GVHD有关，且抗Ro52自身抗体水平升高与BAFF和Ig G1升高有关[29]。综合这些研究表明，B细胞和自身免疫参与了c GVHD的形成。

4、cGVHD的治疗前景

一线标准方案治疗无效的c GVHD患者预后较差，因此，研发新的药物十分迫切。根据发病机制，c GVHD的治疗主要从3个方面进行，一是降低T细胞和B细胞的活化状态，二是抗炎，如减少IL-6、TNF-α、IL-17的分泌，三是减缓纤维化的发展。目前正在开发包括细胞、细胞因子、小分子抑制剂和抗体在内的几种方法治疗c GVHD，一些已经获批应用于临床，但有一些仍处于临床前期和临床试验阶段。

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的非造血干细胞，具有强大的免疫调节作用。间充质干细胞可抑制Th细胞分化、炎性因子产生，抑制抗炎提呈，同时还可以促进Treg细胞增殖，进一步发挥免疫抑制的作用。研究表明，间充质干细胞是治疗难治性c GVHD安全有效的方法[30]。小剂量IL-2能促进Treg细胞增殖、延长Treg细胞生存时间。小分子抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂、脾酪氨酸激酶抑制剂、ROCK2抑制剂、JAK1/2抑制剂、BTK抑制剂、蛋白酶体抑制剂等。近几年，美国食品药品监督管理局批准贝舒地尔、芦可替尼和伊布替尼这3种小分子抑制剂用于治疗c GVHD[31]。ROCK2抑制剂贝舒地尔通过下调STAT3减少Th17细胞和上调STAT5增强Treg细胞治疗c GVHD[32]。芦可替尼是一种JAK1/2抑制剂，通过抑制细胞因子受体介导多种促炎因子信号来抑制T细胞活化。BTK抑制剂伊布替尼在BCR信号传导和B、T细胞的活化中起重要作用，多中心实验证明了伊布替尼可以治疗难治性c GVHD儿童及成人患者[33,34]。抗体包括利妥昔单抗、阿仑珠单抗、英夫利西单抗等。

根据NIH的诊断依据，患者在被诊断为c GVHD时已经明显发病并产生不可逆的不良后果，或许更早发现c GVHD对患者的治疗和预后会有很大帮助。目前，许多血清和血浆候选蛋白如CXCL9、CXCL10、血清BAFF等，细胞如CD19+CD21loB细胞、T细胞和NK细胞亚群等被选择作为c GVHD的诊断生物标志物，但是并未被NIH定义认可和验证[35]。其中CXCL9抑制剂可以抑制趋化因子诱导的T细胞和B细胞募集到受c GVHD影响的靶器官。Salas等[36]证明了催乳素可作为c GVHD的潜在生物标志物，但对c GVHD的严重程度和预后是否有影响还需进一步研究。近来Subburaj等[37]用代谢组学的方法前瞻性地发现α-酮戊二酸可能对早期发现c GVHD具有一定的作用。联合使用潜在代谢生物标志物、免疫细胞、细胞因子可能会是提早诊断c GVHD并提高疗效的好策略。

5、结语

随着allo-HSCT技术的成熟，移植成功率显著上升，但移植后并发症严重影响患者的预后，特别是c GVHD，因此，c GVHD早发现、早诊断和早治疗具有重要意义。在过去几十年中，c GVHD的唯一治疗方法是糖皮质激素，但最近十几年出现许多新的治疗方法，这是基于对c GVHD发病机制的研究，主要在靶向药物、生物制剂、调节细胞疗法等方向取得了进展。针对难治性c GVHD患者应进行更个性化的治疗。c GVHD潜在生物标志物对诊断、预后、预测治疗反应和确定新治疗靶点具有一定价值，未来颇具前景。

参考文献:

[19]吕康康,徐蜜蜜,杜园园,等.Tfh细胞和B细胞在人移植物抗宿主病中的作用及机制.中国实验血液学杂志,2022,30(2):593-599.

基金资助:国家自然科学基金(82070173);云南省优青项目(202101AW070017);

文章来源:胥书惠,满艳,赵进莲,等.慢性移植物抗宿主病的发病机制和治疗前景[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):647-652.