人脑胶质瘤是具有高度恶性､异质性､侵袭性的常见原发性脑肿瘤,发生率和病死率在中枢神经系统恶性肿瘤中均排在首位｡因此,开发新型治疗药物具有重要意义[1-2]｡蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)/锌指蛋白转录因子1(snailfamilyzincfinger1,Snail)可调控癌细胞的恶性生物行为,抑制其激活可减轻肝癌与乳腺癌细胞的增殖与迁移,并减弱神经胶质瘤细胞的增殖､迁移和侵袭活性,且研究表明Akt和GSK-3β抑制剂具有胶质瘤治疗潜力[3-4]｡由此可知,抑制Akt/GSK-3β/Snail信号通路激活可能是人脑胶质瘤的有效治疗手段｡党参炔苷是主要从党参的根中分离出来的一种聚乙炔糖苷,具有抗癌特性,还可降低Akt磷酸化水平,进而显著抑制肺癌细胞的增殖､集落形成､迁移和侵袭[5-6]｡因而推测,党参炔苷可能对人脑胶质瘤起到抗癌作用,且Akt/GSK-3β/Snail可能参与其中｡本研究以党参炔苷干预人脑胶质瘤细胞及其移植瘤裸鼠,探究党参炔苷对人脑胶质瘤的抗癌作用,并阐释Akt/GSK-3β/Snail在其中的调控作用｡

1、材料与方法

1.1主要药品和试剂及仪器党参炔苷(批号:JCBD028)购自四川精萃宝生物科技有限公司(纯度>98%);SC79(批号:S7863)购自美国Selleck公司(纯度97%);细胞计数试剂盒试剂盒､TUNEL检测试剂盒-辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺､AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒､驴抗兔辣根过氧化物酶标记二抗､结晶紫染色液､兔抗人磷酸化Akt(phosphorylatedAkt,p-Akt)､Ki67､Akt､磷酸化GSK-3β(phosphorylatedGSK-3β,p-GSK-3β)､B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(B-celllymphoma-2associatedXprotein,Bax)､GSK-3β､β-肌动蛋白､细胞周期蛋白D1(cyclinD1)､B细胞淋巴瘤2基因(B-celllymphoma-2,Bcl-2)､Snail一抗购自英国Abcam公司;免疫组织化学染色通用试剂盒-辣根过氧化物酶-DAB购自上海机纯实业有限公司｡HT2酶标仪购自奥地利Anthos公司;DM1000生物显微镜､HistoCoreMULTICUT轮转式石蜡切片机购自德国Leica公司;AttuneNxT流式细胞仪､PowerEaseTMTouch350W蛋白电泳套装(含电源､印迹模块套组和凝胶槽)购自美国ThermoFisherScientific公司｡人脑胶质瘤细胞株U373MG,购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司｡

1.2实验动物和细胞选择SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠24只,体质量19~21g,6周龄,赛业(固安)生物科技有限公司提供[SCXK(冀)2021-003]｡常规饲养在SPF级动物实验室内,适应1周后用于实验,室内环境:湿度(60±5)%､温度(23±2)℃､12h昼夜循环｡本研究获得河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会批准(K2024024)｡

1.3体外实验

1.3.1细胞培养和药物浓度筛选细胞培养:U373MG细胞快速解冻后洗涤､复苏,接种至T25培养瓶内用培养液(89%DMEM+10%胎牛血清+1%青链霉素双抗)培养传代,培养条件为95%空气+5%CO2､37℃,传代比例为1︰2~1︰3｡

于96孔板内接种培养第3代U-373MG细胞,随机分为5组(6个复孔/组),分别用终浓度为0､5､10､20､30μmol/L的党参炔苷干预48h,用细胞计数试剂盒试剂(10μl/孔)孵育90min后,置于酶标仪内测定450nm波长处吸光度值(A值),作为评判细胞活力的标准,A值与细胞活力呈正比,后续细胞实验选择可使细胞活力减弱约一半的党参炔苷干预浓度[7]｡

1.3.2细胞分组细胞培养:于24孔板内接种培养第3代U-373MG细胞,根据随机数表法分为4组(6个复孔/组),细胞正常培养且不以任何药物干预的组设置为正常组,细胞以5μmol/LSC79干预的组设置为SC79组[8];细胞以20μmol/L党参炔苷干预的组设置为党参炔苷组;细胞以20μmol/L党参炔苷和5μmol/LSC79联合干预的组设置为党参炔苷+SC79组;各组细胞均干预48h后进行增殖､凋亡与蛋白表达检测｡

1.3.3采用细胞计数试剂盒法和克隆形成实验及流式细胞术检测各组细胞体外增殖和凋亡细胞计数试剂盒法:于96孔板内接种培养第3代U373MG细胞,以“1.3.2”项中方法分组干预后用细胞计数试剂盒法测定各组细胞活力,细胞计数试剂盒实验方法见“1.3.1”克隆形成实验:“1.3.2”项中分组干预后各组U-373MG细胞经胰酶消化､磷酸盐缓冲液洗涤后,用培养基制为单细胞悬液,计数后稀释细胞浓度,于24孔板内以个/孔的细胞量分组接种,培养2周,弃培养基后各组细胞以磷酸盐缓冲液洗涤､4%多聚甲醛固定､结晶紫染色,镜下采集图像并计数各组克隆形成数｡流式细胞实验:“1.3.2”项中分组干预后各组U-373MG细胞经胰酶消化､磷酸盐缓冲液洗涤后,用磷酸盐缓冲液制为单细胞悬液,计数后以每组1×105个的细胞量进行AnnexinV-FITC/PI双染,于流式细胞仪内测定各组细胞凋亡情况,在流式细胞仪生成的散点图上划定四象限门,其中左上象限是细胞碎片,左下象限是正常细胞,右上象限是晚期凋亡细胞(PI+/AnnexinV+),右下象限是早期凋亡细胞(PI-/AnnexinV+)｡

1.3.4采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞增殖和凋亡与Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达分组刮取“1.3.2项中分组干预后的各组U-373MG细胞,4℃下于RIPA试剂内裂解,离心提取总蛋白,利用BCA法测量其浓度后在沸水浴内变性,配备并灌制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶,以每组20μg的蛋白量上样做电泳分离,通过全湿电转进行蛋白印迹,膜上蛋白经5%脱脂牛奶封固后孵育抗体,一抗均于4℃下孵育12h,稀释比:β-肌动蛋白(1︰2000)､Bax(1︰2000)､Bcl-2(1︰1000)､cyclinD1(1︰2000)､p-GSK-3β(1︰1000)､GSK-3β(1︰000)､Akt(1︰2000)､p-Akt(1︰1000)､Snail(1︰1000),二抗稀释比为1︰1000并于37℃下孵育2.5h,各组蛋白利用增强化学发光检测盒显色,凝胶成像后定量其灰度值,算出各组相对于内参β-肌动蛋白的比值,即为蛋白相对表达｡

1.4体内实验

1.4.1造模和分组及药物干预选取第3代U373MG细胞制为单细胞悬液,以1×106个的细胞量接种在裸鼠右腋皮下,皮下注射细胞悬液体积为0.2ml,当皮下长出约100mm3瘤块时,提示移植瘤裸鼠制备成功[9]｡根据随机数表法分为4组(6只/组),裸鼠腹腔注射10mg/kg党参炔苷(溶于生理盐水,1次/d,注射体积5ml/kg)的组设置为党参炔苷组[7];裸鼠腹腔注射50mg/kgSC79(溶于0.9%氧化钠溶液,1次/d,注射体积5ml/kg)的组设置为SC79组[8];裸鼠以10mg/kg党参炔苷和50mg/kgSC79进行联合腹腔注射(党参炔苷和SC79同时溶于生理盐水,1次/d,注射体积5ml/kg)的组设置为党参炔苷+SC79组;裸鼠腹腔注射5ml/kg生理盐水的组设置为正常组,各组裸鼠均干预21d｡

1.4.2测定各组裸鼠移植瘤的瘤体质量和瘤体积并采集标本药物干预结束后的各组裸鼠进行安乐死,剥离皮下移植瘤,取出拍照后于电子天平内测出瘤体质量,利用游标卡尺测量移植瘤的最短及最长直径,计算瘤体积｡冰上剪取约100mg新鲜移植瘤组织存入液氮内;剩余移植瘤组织以常规方法进行固定､梯度脱水､石蜡包埋后切片备检｡

1.4.3采用免疫组织化学染色与TUNEL染色检测裸鼠肿瘤细胞增殖､凋亡情况取完好无褶皱的瘤组织切片进行常规脱蜡､梯度水化,孵育3%H2O2清除内源性过氧化氢酶,水洗后分别孵育Ki67､cyclinD1､Bax与Bcl-2一抗,稀释比均为1︰100并于4℃下孵育12h,水洗后按免疫组织化学染色通用试剂盒说明指导孵育对应二抗并进行DAB染色,镜下采集经免疫组织化学染色后的瘤组织图像,计算细胞后量化各组Ki67､cyclinD1､Bax与Bcl-2阳性比例｡取脱蜡､水化后的瘤组织切片,按TUNEL检测试剂盒说明指导进行TUNEL染色,镜下采集经TUNEL染色后的瘤组织图像,计算细胞后量化各组TUNEL阳性比例｡

1.4.4采用蛋白免疫印迹法检测各组移植瘤与Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达取出液氮内的各组移植瘤组织,提取总蛋白后采用蛋白免疫印迹法检测各组Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白相对表达,具体实验方法见“1.3.4”｡

1.5统计学方法用GraphPadPrism9.0软件,正态分布的计量资料以x��±s表示,用独立样本t检验,以Bartlett检验进行方差齐性检验,若方差齐采用单因素方差分析进行组间多重比较,进一步进行两两比较,采用q检验或Nemenyi检验,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1体外实验结果

2.1.1各组U-373MG细胞体外增殖和凋亡情况与正常组比较,党参炔苷组细胞活力､克隆形成数显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05);与正常组比较,SC79组细胞活力､克隆形成数显著升高,凋亡率显著降低(P<0.05);与党参炔苷组比较,党参炔苷+SC79组细胞活力､克隆形成数显著升高,凋亡率显著降低(P<0.05,图1~5,表1)｡

图1正常组

图2SC79组

图3党参炔苷组

图4党参炔苷+SC79组

图1~4各组U-373MG细胞克隆形成情况结晶紫染色×10

图5各组U-373MG细胞凋亡流式细胞术

表1各组细胞活力和克隆形成数及凋亡率比较(x��±s,n=6)

2.1.2各组U-373MG细胞增殖和凋亡与Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达情况与正常组比较,党参炔苷组cyclinD1､Bcl-2､Snail､p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β表达降低,Bax表达升高(P<0.05);与正常组比较,SC79组cyclinD1､Bcl-2､Snail､p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β表达升高,Bax表达降低(P<0.05)｡与党参炔苷组比较,党参炔苷+SC79组cyclinD1､Bcl-2､Snail､p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β表达升高,Bax表达降低(P<0.05,图6,表2)｡

图6各组U-373MG细胞Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达电泳图

表2各组U-373MG细胞增殖和凋亡与Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白相对表达比较(x��±s,n=6)

2.2体内实验结果

2.2.1各组U-373MG裸鼠肿瘤生长检测结果与正常组比较,党参炔苷组瘤体质量､瘤体积显著降低(P<0.05);与正常组比较,SC79组瘤体质量､瘤体积显著升高(P<0.05);与党参炔苷组比较,党参炔苷+SC79组瘤体质量和瘤体积显著升高(P<0.05,图7,表3)｡

图7各组U-373MG裸鼠移植瘤情况

表3各组U-373MG裸鼠瘤体质量和瘤体积比值(x��±s,n=6)

2.2.2各组U-373MG裸鼠肿瘤细胞增殖和凋亡情况与正常组比较,党参炔苷组Ki67､cyclinD1､Bcl-2阳性比例显著降低,TUNEL､Bax阳性比例显著升高(P<0.05);与正常组比较,SC79组Ki67､cyclinD1､Bcl-2阳性比例显著升高,TUNEL､Bax阳性比例显著降低(P<0.05);与党参炔苷组比较,党参炔苷+SC79组Ki67､cyclinD1､Bcl-2阳性比例显著升高,TUNEL､Bax阳性比例显著降低(P<0.05,表4,图8~20)｡

图8正常组图9SC79组图10党参炔苷组图11党参炔苷+SC79组图8~11各组U-373MG裸鼠肿瘤细胞增殖情况免疫组织化学染色×200

图12正常组图13SC79组图14党参炔苷组图15党参炔苷+SC79组图12~15各组U-373MG裸鼠肿瘤细胞增殖蛋白表达情况免疫组织化学染色×400

图16正常组图17SC79组图18党参炔苷组图19党参炔苷+SC79组图16~19各组U-373MG裸鼠肿瘤细胞凋亡情况TUNEL染色×200

表4各组裸鼠移植瘤细胞凋亡蛋白阳性比例比较(%,x��±s,n=6)

图20各组U-373MG裸鼠肿瘤细胞凋亡蛋白表达情况×200注:Bcl-2为B细胞淋巴瘤2基因;Bax为B细胞淋巴瘤2相关X蛋白

2.2.3各组U-373MG裸鼠移植瘤Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达情况与正常组比较,党参炔苷组p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β与Snail表达显著降低(P<0.05);与正常组比较,SC79组p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β与Snail表达显著升高(P<0.05);与党参炔苷组比较,党参炔苷+SC79组p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK-3β与Snail表达显著升高(P<0.05,图21,表5)｡

图21各组U-373MG裸鼠移植瘤Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达电泳图

表5各组U-373MG裸鼠移植瘤Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白相对表达比较(x��±s,n=6)

3、讨论

目前人脑胶质瘤的临床治疗相对不成熟,手术+放化疗的综合治疗是最常用的临床治疗手段,还有新型的免疫和靶向疗法得到应用,虽可延缓癌症进展,但存在癌细胞扩散､耐药和免疫逃逸问题,多数人脑胶质瘤患者的预后仍然很差,因此,寻求高效且价格适宜的新型抗癌药物是目前人脑胶质瘤临床研究领域的热点和难点[10-12]｡我国传统中医药以及天然活性产物数量众多､来源丰富且不良反应相对较小,在抗肿瘤方面具有多层次､多靶点､维度广的独特优势,党参炔苷作为从中药材党参中提取的天然活性成分,相比其他天然产物,具有来源广泛､稳定性良好､提取成本低､生物活性高､不良反应小和耐药性低等独特优势,可起到明显抗肿瘤作用,能呈浓度依赖性地抑制胃癌细胞增殖,并可诱导胃癌细胞凋亡,有效抑制体内胃肿瘤的生长,还可通过诱导细胞凋亡而对乳腺癌细胞发挥抗癌作用[13-14]｡本研究结果显示,以党参炔苷干预人脑胶质瘤细胞株U-373MG,可降低其细胞活力､克隆形成数并升高其细胞凋亡率,表明党参炔苷可抑制人脑胶质瘤细胞增殖并促使其凋亡;以党参炔苷干预U-373MG移植瘤裸鼠,可降低其移植瘤的瘤体质量和瘤体积,升高TUNEL阳性比例,并减弱cyclinD1､Bcl-2与Snail蛋白表达,增强促凋亡蛋白Bax表达,表明党参炔苷可抑制体内人脑胶质瘤细胞增殖与肿瘤生长,诱导体内肿瘤细胞凋亡,揭示党参炔苷可通过抑制细胞增殖､促进细胞凋亡而对人脑胶质瘤细胞发挥抗癌作用｡

Akt/GSK-3β/Snail信号通路在细胞增殖､转移和凋亡过程中起到重要调控作用,与许多人类恶性肿瘤的发生､生长和进展有关,阻断Akt/GSK-3β/Snail信号通路可抑制肺癌小鼠模型中肿瘤生长和转移,并延长其生存期,还可通过抑制上皮-间充质转化而降低胰腺癌细胞的侵袭和迁移能力,抑制Akt/GSK-3β信号通路激活可减弱胶质母细胞瘤细胞的增殖､侵袭､迁移活性和化疗放射抗性[15-17]｡本研究结果显示,以党参炔苷干预U-373MG细胞与移植瘤裸鼠,均可降低p-Akt/Akt､p-GSK-3β/GSK3β与Snail蛋白表达,表明Akt/GSK-3β/Snail信号通路与党参炔苷对人脑胶质瘤细胞的抗癌功效有关;以党参炔苷和Akt激活剂SC79联合干预U-373MG细胞与移植瘤裸鼠,可减弱党参炔苷对人脑胶质瘤细胞体内外增殖的抑制作用,削弱其对人脑胶质瘤细胞体内外凋亡的促进作用,表明SC79可逆转党参炔苷对人脑胶质瘤细胞的抗癌作用,揭示党参炔苷是通过阻止Akt激活而抑制人脑胶质瘤增殖,并促进其凋亡｡

综上所述,党参炔苷可在体内外诱导脑胶质瘤细胞凋亡,并减弱其体外细胞活力和克隆形成能力,抑制脑胶质瘤裸鼠体内移植瘤生长,阻止Akt/GSK-3β/Snail信号通路激活传导可能是党参炔苷起到上述抗脑胶质瘤作用的药理机制,本研究证实了党参炔苷对人脑胶质瘤具有治疗潜力,并初步阐明了Akt/GSK-3β/Snail在其中的作用机制,有助于党参炔苷在临床脑胶质瘤治疗中的开发应用｡但本研究仅使用U-373MG细胞系对党参炔苷的脑胶质瘤作用进行探讨,未涉及其他胶质瘤亚型,存在一定局限性,后续还需在其他胶质瘤亚型中进行验证｡

参考文献:

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基金资助:2023年张家口市市级科技计划项目(2322180D);

文章来源:刘明,张寅,柳永达,等.党参炔苷对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的调控作用及机制[J].中华老年心脑血管病杂志,2025,27(07):952-958.