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CIP4基因在长爪沙鼠NAFLD模型中的表达及与β-catenin蛋白相互作用的免疫共沉淀的实验分析

2020-08-07 254 上传者：管理员

摘要：目的获得长爪沙鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型中CDC42作用蛋白4(CIP4)基因的表达规律及是否受β连环蛋白(β-catenin)调控的证据。方法 3月龄雄性长爪沙鼠30只采用随机数字表法分为正常组6只和模型组24只，模型组按饲喂高脂饲料的时间不同分为2周组、4周组、8周组、12周组，每组6只。按组采集肝脏大叶标本4份，HE染色及Masson染色检测肝脏的病理变化，荧光定量PCR(qPCR)法检测CIP4mRNA相对表达量，蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测CIP4蛋白相对表达量，免疫共沉淀(CoIP)验证CIP4与β-catenin的相互作用。结果肝病理学检测结果显示，随着造模时间的延长，模型组沙鼠均出现肝脏脂肪病变(单纯脂肪肝，2～4周造模，S0～S1)，脂肪性肝炎(4～8周造模，脂堆积形成肝细胞的肿胀，坏死和空泡，少量纤维化出现，S1～S2)，肝纤维化(8～12周造模，S2～S3)，部分有假小叶形成。qPCR和Westernblot结果显示，随着造模时间延长，CIP4mRNA和蛋白相对表达量均下降。模型组被CoIP下来的CIP4蛋白明显下降，这表明模型组β-catenin与CIP4的相互作用减少。结论随着NAFLD病程的进展，长爪沙鼠模型CIP4呈现降低趋势，其作用受β-catenin的调控。

关键词：
CDC42作用蛋白基因
免疫共沉淀
甲状腺素受体作用因子10
脂肪肝
长爪沙鼠
非酒精性脂肪性肝病模型
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CDC42作用蛋白4(CDC42interactingprotein4,CIP4）又称作甲状腺素受体作用因子10，能与甲状腺素受体结合，其表达受全反式维甲酸调节，作为活化的CDC42的一种下游靶蛋白，CIP4在细胞骨架（由肌动蛋白、微管及中间丝共同构成）的形成和重排，调节细胞的变形（伪足）、黏附、吞噬及胞质移动等过程中起着重要的作用[1]。CIP4能下调表皮生长因子受体[2]，沉默CIP4基因后，导致间充质干细胞出现多种分化倾向并能减少肿瘤的转移[3]。CIP4基因敲除小鼠表现出餐后低血糖，对胰岛素不敏感，对葡萄糖、转铁蛋白吸收下降等多方面效应[4]。高脂饮食造成胰岛素抵抗的大鼠磷酸酶高表达从而抑制了脂肪组织中CIP4的表达[5]。肾纤维化研究表明，在转化生长因子β1(TGF-β1）参与下（Wnt信号通路），CIP4可能是通过酪氨酸残基的磷酸化而促使β连环蛋白（β-catenin）与E-钙黏附素（E-cadherin）解聚的方式来促进上皮细胞向间充质细胞转化（EMT），从而发挥其促肾脏纤维化的作用[6]。但该基因在TGF-β1参与下的肝纤维化中是否与β-catenin有相互作用的关系或CIP4的表达是否受β-catenin调控仍不明确。鉴于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在肝领域研究的迅速发展，笔者课题组自2005年以来历经10年时间建立的长爪沙鼠NAFLD模型目前以成模时间短、病理谱全面、与人类症状相似性高且适于动态观察病程进展的特色而成为一个不可多得的模型[7,8]。本研究试图用免疫共沉淀（CoIP）的方法来验证长爪沙鼠NAFLD模型中CIP4与β-catenin两者的相互关系，为研究肝纤维化的机制提供证据。

1、材料和方法

1.1模型的建立

3月龄雄性长爪沙鼠30只购自浙江省医学科学院实验动物中心并饲养于该中心的动物房[许可证号：SCXK（浙）2014-0001,SYXK（浙）2014-0008]，体质量50～70g，采用随机数字表法分为正常组（Z组）6只和模型组（M组）24只。M组按饲喂高脂饲料的时间不同分为2周组（2M组）、4周组（4M组）、8周组（8M组）、12周组（12M组），每组6只。高脂饲料由本课题组自行配制，成分及配比如下：80.5%的基础料（符合GB14924.3-2010）、7%的猪油、2%的胆固醇、0.5%的胆盐、10%的蛋黄粉。本研究经浙江省医学科学院实验动物伦理委员会批准同意，伦理审批号：2018-094。

1.2肝脏样品的采集

M组长爪沙鼠分别于造模后2、4、8、12周末的最后一天晚上禁食禁饮（Z组处理同M组），CO2麻醉，取肝脏的大叶部分，分成4份，1份用于制作病理切片；其余3份贮存于-80℃，用于肝脏CIP4基因的荧光定量PCR(qPCR）、蛋白免疫印迹（Westernblot）及与β-catenin相互作用的CoIP实验。

1.3HE染色、Masson染色与肝纤维化的分期

取各组长爪沙鼠肝脏大叶相同部位一片，制作切片并做HE染色与Masson染色观察。根据中华医学会肝纤维化诊断及治疗共识（2019年）中肝纤维化的分期标准，将模型各阶段分为S0～S3期。S0期：肝小叶结构基本正常，小叶间仅含有少量结缔组织和胶原纤维，汇管区和中央静脉大小正常，偶见轻度脂肪变性。S1期：汇管区、中央静脉均扩大，小叶结构清晰，细胞完整，偶见小叶间结缔组织和胶原纤维有所增加，肝组织呈轻度脂肪性。S2期：汇管区、中央静脉均明显扩大，有较多肝细胞发生脂肪变性，小叶间结缔组织和胶原纤维明显增加，在汇管区之间，中央静脉与汇管区之间均可见有胶原纤维沉积，逐渐形成完整的一层纤维分隔，所谓桥接。S3期：胶原纤维在小叶间、部分汇管区与门管区之间形成完整的小叶间隔，肝和正常结构受到明显破坏，可见纤维桥接，组织脂肪变性。

1.4各组沙鼠CIP4mRNA相对表达量检测

采用qPCR法。二步法提取总RNA，然后DNaseI消化去基因组DNA，反转录合成第一链，反转录反应采用杭州宝赛公司的反转录试剂盒（RT02020）。提取总RNA的组分包括DNaseI2μl,Buffer2μl,RNA18μl,37℃反应10min，加入2μl终止Buffer,70℃10min灭活DNaseI；反转录组分包括：M-MLV1μl,5×RTBuffer4μl,RNaseA抑制剂1μl,OligdT(18)1μl,dNTP1μl,RNA1μg,Rnase-freeH2O补至20μl,42℃45min,70℃10min灭活M-MLV。mRNA引物设计与合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，以GAPDH为内参对照，引物序列见表1。qPCR反应体系如下：20μl体系里含有2×荧光定量PCRMix10μl，上游引物（10μM)1μl，下游引物（10μM)1μl，模板DNA1μl，双蒸水7μl。反应程序如下：94℃模板预变性1min,94℃模板变性10s,58℃引物退火10s,72℃PCR延伸10s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平。

表1引物序列

1.5各组沙鼠CIP4蛋白相对表达量检测

采用Westernblot法。冷PBS洗净肝脏组织块并剪碎，适当体积的组织预冷裂解液（使用前数分钟内加入PMSF，终浓度1mM）匀浆，转管、混匀、吹打、裂解，12000rpm4℃离心10min，上清液分装，BCA法测蛋白浓度，并标准化成35μg/样。制备分离胶浓度为10%，浓缩胶为5%，标准上样，浓缩胶用80V电压，分离胶改用120V，电泳毕后湿转法200mA转膜1h。然后进入免疫印迹（IB），室温下用5%的脱脂牛奶（0.5%TBST配置）封闭膜2h（边摇边封闭），用1:1000的比例稀释一抗β-catenin和CIP4,4℃过夜。第2天用1×TBST室温下摇洗3次，间隔15min，用1:5000的比例稀释二抗（goatanti-rabbitHRP二抗），室温下孵育2h，期间用1×TBST在室温下摇洗3次，间隔15min。之后用化学发光法显影，ImageJ软件图像分析。

1.6CIP4与β-catenin的CoIP验证

每只沙鼠称取100mg组织样品，用PBS洗2次，尽量洗去组织的血液成分，匀浆之后，13000rpm4℃离心10min。转移上清液到新的EP管内，取10%体积的上清液加入等体积5×SDS作为Input，剩余放置冰上待用；将上述剩余裂解液加入一定体积的NP40lysisBuffer（加1mMPMSF和1mMDTT）补齐500μl，根据抗体说明书加入1μg的抗体β-catenin,4℃摇床上摇过夜；第2天，每个EP管加入20μlproteinA/Gbeads,4℃摇床上继续摇2h；取出免疫沉淀（IP）管，4℃1000rpm离心1min，用磁性分离器分离beads，用200μl的WashBuffer洗3遍，beads加入50μl的2×SDS煮样。其余步骤同1.5。

1.7统计学处理

采用SPSS13.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1肝脏形态学检查

HE染色观察到Z组沙鼠肝组织结构正常，细胞核大而清晰，胞质丰富。M组沙鼠肝组织呈脂肪病变，绝大多数肝细胞胞质内有大小不等的脂肪空泡，细胞核大小不均，被脂肪空泡挤向一侧，肝细胞出现一定程度的坏死。Masson染色观察到Z组沙鼠肝窦组织结构整齐，细胞核蓝染而清晰，胞质丰富，视野下细胞无变性、肿胀，无胶原纤维、可见明显的小叶间结缔组织。M组沙鼠肝组织大部分肝细胞网泡状，气球状肿胀，细胞核固缩崩解，脱落，细胞间脂肪空泡，被脂肪空泡挤向一侧，并在汇管区及其周围、细胞间可见纤维组织增生，出现纤维化（图1，见插页）。

2.2各组沙鼠CIP4mRNA相对表达量比较

各组沙鼠CIP4mRNA相对表达量排序为4M组>Z组>8M组>12M组>2M组，谷值出现在2M组，即单纯脂肪肝阶段。峰值出现在4M组，即CIP4mRNA相对表达量峰值出现在4M组，这个阶段是处在S1～S2期，即脂肪性肝炎早期阶段，见图2。

2.3各组沙鼠CIP4蛋白相对表达量比较

Z组CIP4蛋白相对表达量最高，M组CIP4蛋白相对表达量均有所下降，各组CIP4蛋白相对表达量排序为Z组>8M组>12M组>4M组>2M组。谷值出现在2M组，即单纯脂肪肝阶段；峰值出现在8M组，即重症脂肪性肝炎及早期的肝纤维化阶段，见图3。8M组出现CIP4蛋白相对表达量的峰值可能与其处在S2～S3期的转折点有关，CIP4蛋白相对表达量在从正常到单纯的脂肪肝阶段是上调（S0～S1,Z组/2M～4M），接着随着脂肪不停地堆积，自身保护性下调，肝稳态出现第一次平衡，但肝细胞一直进行修复，一直到炎症出现及纤维化形成时（S1～S2,4M～12M），肝细胞破坏严重，肝实质细胞凋亡，而肝星状被激活，肝脏修复能力渐衰，肝稳态出现第二次平衡，但此时CIP4蛋白相对表达量有个峰值（8M组），但此峰值不及Z组的表达量大。在肝脏修复能力逐渐衰竭过程中，CIP4蛋白相对表达量下降，肝脏变硬的过程中，肝脏细胞胞吞、吐能力也随之改变。

图2各组沙鼠CIP4mRNA相对表达量比较

图3各组沙鼠CIP4蛋白相对表达量比较

2.4CIP4与β-catenin的相互作用

从图4a-d（原始图）可以看出，CIP4蛋白大小为70～100kD，β-catenin蛋白大小为100～130kD。Input中可以看出，Z组和M组中CIP4和β-catenin蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。利用β-catenin抗体IP之后，与Z组相比，M组中沉淀的CIP4蛋白相对表达量明显下降，IB之后（图4e）表明造模之后β-catenin与CIP4的相互作用减少（M1和M2分别对应S0～S1与S2～S3期的模型，这两组病理进程对应于脂肪肝与炎症及肝纤维化阶段，即随着病理进程发展，β-catenin与CIP4的相互作用越来越少）。

3、讨论

本实验病理结果证实造模2周为单纯脂肪肝（S0期），4周后开始出现纤维化（S1期），8周出现桥接，12周部分肝叶形成假小叶，HE染色和Masson染色在2、4、8和12周造模过程中纤维化进展的程度高度一致（与S0～S3期吻合）。这时CIP4mRNA相对表达量在2周时先是下调，接着在4周时上调到峰值，接着又开始下降，而CIP4蛋白相对表达量则较CIP4mRNA相对表达量迟一点，到8周（S2期）才达峰值，随后下降，谷值出现在2周（S0期）。从总体表达量上看，CIP4mRNA和蛋白相对表达量均与炎症和纤维化形成有关，且在这个过程中呈现下降趋势。CIP4是一个调节膜变形卷曲的细胞肌动蛋白，兼有生长因子受体内吞及运输载体作用，其低表达导致膜变硬，弱化了T细胞的迁移及黏附的功能，活化了p38/丝裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）通路[9]。本实验CIP4随着NAFLD的持续进展，呈现出一个峰值后，即转向持续低表达，这个过程也是脂肪的不断堆积，肝脏柔软度越来越差，趋向硬化的过程。

最新的肝纤维化相关研究进展认为促纤维化因子（TGF-β1、NF-κB、肾素、血管紧张素等）上调了细胞外基质基因表达，同时抑纤维化因子IFN-γ致促胶原降解基因表达下降，致胶原过量堆积而致纤维化[10]，以上理论中关于CIP4的作用尚是空白。抑制不同细胞中CIP4基因后导致细胞多种分化结果，其中一种是纤维化，这说明调节该基因可以用来研究肝纤维化的发生机制。CIP4是PCH家族的一个成员，具有与磷脂酰丝氨酸结合的FER类似区和一个SH3区域。该基因的转录激活/抑制主要取决于其3个结构域，一个是TR-RXR/PPAR-RXR二聚体的结合区（FCH区），一个是CDC42结合的HR1区，另一个是SH3区，即富含脯氨酸，可与下游特定泛素化的靶蛋白结合[11]。肿瘤细胞实验和肾纤维化研究表明CIP4可通过SH3区的脯氨酸与β-catenin结合，而β-catenin（第654位点酪氨酸残基）磷酸化易被泛素化降解，鉴于β-catenin是一个经典的信号转导蛋白，因此可能通过与CIP4结合而对CIP4表达起调节作用[6,12]。本研究中CoIP法结果表明，M组中CIP4与β-catenin之间结合程度小于Z组，而且可能随着肝纤维化的发展结合程度越来越小。结合该基因在其他领域[13,14]的研究进展推断随着NAFLD病程的进展，CIP4内吞作用的破坏导致β-catenin出现核转位，细胞极性发生变化，致使肝细胞黏附连接复合物（上皮细胞转分化过程中的一种细胞形态）的完整性不能维持，从而促进肝细胞转分化过程，其结果是肝实质逐渐为肝星状细胞取代，肝脏逐渐纤维化，这时肝脏外观上看是从柔软趋向硬化的过程。

图4CIP4与β-catenin的CoIP结果

综上所述，长爪沙鼠NAFLD模型中CIP4随着造模时间的延长，呈现出低表达的趋势，可能与炎症及纤维化有关且受β-catenin的调控。

图1长爪沙鼠NAFLD肝脏病理进程图

参考文献：

[6]张亚敏.CIP4在肾脏纤维化中的表达及其与β-catenin的关系[D].武汉:华中科技大学,2011.

[7]刘月环,吴旧生,应华忠,等.长爪沙鼠NAFLD模型的建立及其遗传学的研究[J].中国比较医学杂志,2017,27(5):9-11.

[8]王志远,刘月环.长爪沙鼠肝脏基因组DNA甲基化水平检测[J].实验动物与比较医学,2018,38(1):44-47.

[10]厉有名,胡申江.内科学新进展:器官纤维化进展[M].2版.杭州:浙江大学出版社,2018:479-480.

吴鸿儒,吴旧生,王志远,刘月环.长爪沙鼠NAFLD模型中CIP4基因的表达及与β-catenin蛋白相互作用的免疫共沉淀验证[J].浙江医学,2020,42(10):995-999+1103.

基金:浙江省自然科学基金项目(LY16H030011);浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目(2011C37096,2015C37102);浙江省医药卫生平台骨干人才基金项目(2015RCA006)