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创伤致大鼠心肌细胞凋亡中内质网应激的作用分析
摘要：目的：探讨内质网应激（ERS）在创伤致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法：应用Noble-Collip创伤仪构建机械创伤SD大鼠模型，并将大鼠随机分为伪创伤组（n=6），创伤组（创伤后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h各时点n=6）和创伤+ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）组（n=6）。用试剂盒检测大鼠心肌组织凋亡蛋白caspase-3活性；用Western blot检测大鼠心肌组织caspase-3的活化水平，ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、转录激活因子6（ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和需肌醇酶1α（IRE1α）的表达或磷酸化水平，以及ERS相关凋亡分子C/EBP同源蛋白（CHOP）和caspase-12的表达或活化水平。结果：与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织caspase-3活性增强，cleaved caspase-3、GRP78、ATF6、磷酸化PERK、磷酸化IRE1α、CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平均显著升高（P<0. 05或P<0. 01）；而给予创伤大鼠4-PBA处理后，caspase-3活性及CHOP、cleaved caspase-12和cleaved caspase-3蛋白水平均显著降低（P<0. 05）。结论：创伤所致大鼠心肌细胞凋亡可能是由于激活ERS凋亡途径引起的。
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随着我国城市现代化建设的高速发展，交通业、建筑业等发生意外事故造成的创伤患者逐年增多。临床研究表明，创伤不仅可直接损伤心脏，还可导致继发性心脏损伤（trauma-induced secondary cardiac injury,TISCI)[1]。此类患者在创伤后24 h内无任何心功能指标的异常，但在创伤后数天或数周出现心功能障碍，病情隐匿，极易漏诊，死亡风险极高[2]。
已有研究证实，心肌细胞凋亡是TISCI的主要原因[3]，但其具体机制尚不清楚。本课题组前期研究显示，在引起创伤大鼠心肌细胞凋亡的主要途径中，介导内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）凋亡途径的关键分子caspase-12最早被激活。应激、缺血、缺氧等多种病理因素刺激可导致内质网稳态失衡，从而引起ERS[4]。短暂而轻微的ERS发生时，内质网上的跨膜传感器转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）和需肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）介导的3条信号通路相继被激活，诱导适应性反应以维持内质网稳态，进而保护细胞。但若ERS时间延长或加剧时，ERS凋亡途径被激活，导致细胞凋亡[5]，进而参与多种疾病的发生发展。本研究应用Noble-Collip创伤仪构建机械创伤大鼠模型，通过检测ERS及其凋亡途径的激活情况，探讨创伤致大鼠心肌细胞凋亡的潜在机制。
材料和方法
1.材料
1.1试剂
Krebs-Henseleit(K-H）液、蛋白酶抑制剂PMSF、RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（博士德生物工程有限公司）；抗GAPDH抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulated protein 78,GRP78）、IRE1α、p-IRE1α、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）、caspase-12和caspase-3抗体（Abcam）；抗PERK、pPERK和cleaved caspase-3抗体（Cell Signaling Technology）；抗ATF6抗体（Santa Cruz);4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）购自Sigma;caspase-3活性检测试剂盒（南京碧波生物科技有限公司）。
1.2动物
清洁级健康雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量180～220 g，由山西医科大学实验动物中心提供[合格证号为SCXK（晋）2015-0001]。
2.方法
2.1实验大鼠的分组及模型的构建
将大鼠随机分为伪创伤（sham）组（n=6）、创伤（trauma）组（创伤后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h各时点n=6）和创伤+ERS抑制剂4-PBA组（n=6）。按照参考文献[6,7]的方法对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后置于直径30 cm的Noble-Collip创伤仪中，创伤仪以40 r/min的速率运行5 min，共200 r。伪创伤组大鼠被胶带固定于创伤仪内，在转动过程中不会跌落造成损伤；创伤组和创伤+4-PBA组大鼠每转动1圈跌落1次，进而造成创伤；创伤+4-PBA组大鼠在创伤后即刻腹腔注射4-PBA(100 mg/kg）。
2.2大鼠离体心功能检测
大鼠麻醉后，迅速开胸取心脏，放入预冷的K-H液中，迅速修剪后将主动脉固定到Langendorff灌流装置上，以K-H液行主动脉逆行灌流，保证恒压100 cmH2O，恒温37℃，并充以95%氧气和5%二氧化碳混合气体。待心脏稳定跳动后，将带球囊的心导管经过房室瓣置于左心室内，球囊内充有灌流液，使左心室舒张末压维持在10mmHg。球囊导管另一端与压力换能器相连，待各项心功能指标稳定后对左室内压进行采集。采用BL-410生物信号记录分析系统记录大鼠±dp/dtmax数据。
2.3大鼠心肌组织样品的制备
伪创伤组大鼠经创伤仪运转5 min后处死；创伤组大鼠按照创伤后不同时点依次处死；创伤+4-PBA组大鼠在ERS标志物表达最高的时点即创伤后6 h处死。处死大鼠后，开胸，取心脏，于4℃磷酸盐缓冲液中洗去残余血液，冰上取心尖组织，剪碎，裂解，提取蛋白用于后续实验。
2.4Western blot
制胶，上样，电泳，转膜，封闭，孵育I抗（GRP78抗体按1∶2 500稀释，PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α和caspase-12抗体按1∶1 000稀释，ATF6、CHOP和caspase-3抗体按1∶500稀释），4℃过夜；用洗涤缓冲液洗膜3次，每次10 min，孵育II抗2h(HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG按1∶2 000稀释）；洗膜，用UVP凝胶成像系统曝光。以目的蛋白灰度值与内参照GAPDH灰度值的比值反映蛋白表达水平。
2.5 caspase-3活性检测
取各组心肌组织，裂解，测定蛋白浓度，根据分组在96孔酶标板上设置空白对照孔和样品孔；按照说明书依次加入样品裂解液、反应缓冲液和底物。催化底物Ac-DEVD-p NA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide）被caspase-3剪切后，会产生黄色的p NA，用酶标仪测定的吸光度（A）可反映caspase-3的活性。
3.统计学处理
用GraphPad Prism 7.0软件统计并作图。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较用单因素方差分析及LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.创伤导致大鼠离体心功能降低，心肌组织凋亡执行蛋白caspase-3活性增强
与伪创伤组相比，创伤组大鼠24 h内各时点（0、3、6、12和24 h）心电图、平均动脉压及在体心功能（包括±dp/dtmax）均未出现显著异常，心脏、肝脏、肾脏和肠管均未出现显著出血，仅观察到肝脏和肠管轻度充血，且创伤大鼠通常在创伤后1～3 h苏醒，24 h内生存率100%。但离体心功能指标±dp/dtmax均在创伤后24 h显著降低（P<0.05或P<0.01），见表1。
表1创伤24 h内大鼠离体心功能指标±dp/dtmax的变化
与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织中凋亡执行蛋白caspase-3活性形式（cleaved caspase-3）在创伤后6 h显著增加（P<0.05),12 h达到最高峰（P<0.01），见图1A;caspase-3活性检测试剂盒的结果同样显示，caspase-3活性在创伤后6 h显著升高（P<0.01),12 h达到最高水平（P<0.01），见图1B。
图1创伤后不同时点凋亡执行蛋白caspase-3在大鼠心肌组织中的表达和活性
2.创伤诱导大鼠心肌组织ERS标志分子GRP78、ATF6、p-PERK和p-IRE1α水平升高
与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织GRP78蛋白表达在创伤后3 h开始显著增加（P<0.05），在创伤后6 h达到最高水平（P<0.01），见图2A;ATF6蛋白表达在创伤后6 h开始增加（P<0.05),12 h达到最高水平（P<0.01），见图2B;PERK和IRE1α表达在创伤后无显著变化（P>0.05），但磷酸化水平在创伤后3 h显著升高（P<0.05),6 h达到最高（P<0.01），见图2C、D。
3.创伤导致大鼠心肌组织ERS相关凋亡蛋白CHOP表达升高及caspase-12活化
与伪创伤组相比，创伤组大鼠心肌组织CHOP表达在创伤后6 h显著增加（P<0.05),12 h达到最高水平（P<0.01），见图3A;caspase-12活性形式（cleaved caspase-12）在创伤后3 h水平升高（P<0.05),6 h达到高峰（P<0.01），见图3B。
4.抑制ERS可降低创伤大鼠心肌组织CHOP表达并抑制caspase-12活化
与创伤组相比，给予ERS抑制剂4-PBA后，创伤大鼠心肌组织CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平显著降低（P<0.05），见图4。
图2创伤后不同时点ERS标志分子GRP78、ATF6、PERK和IRE1α在大鼠心肌组织中的表达和磷酸化水平
5.抑制ERS可减少创伤大鼠心肌组织caspase-3活化
与创伤组相比，给予4-PBA干预后创伤大鼠心肌组织中cleaved caspase-3蛋白水平显著降低（P<0.05），见图5A；采用caspase-3活性检测试剂盒对心肌组织caspase-3活性进行测定，结果同样显示，4-PBA干预后创伤大鼠心肌组织caspase-3活性显著下调（P<0.05），见图5B。
讨论
TISCI是一种隐匿性疾病，常因贻误治疗时机导致患者死亡[8]，而其具体发病机制尚不清楚。已有的研究表明，在创伤动物模型中，创伤可导致心肌细胞凋亡，进而引起心功能降低及随后的继发性心脏损伤[6,9]。引起细胞凋亡通常有3条途径：死亡受体途径、线粒体途径和ERS途径[10]。在前期研究中，本课题组对介导3条凋亡途径的标志性蛋白caspase-8、caspase-9和caspase-12分别进行了活性检测，显示介导ERS凋亡途径的caspase-12最早被激活[7]。为了探讨创伤是否通过激活ERS进而导致大鼠心肌细胞凋亡，本研究首先根据参考文献[6]和课题组既往研究成功复制造成继发性心脏损伤的创伤大鼠模型[7,11,12]，并对创伤大鼠心肌组织凋亡的发生进行验证，结果显示凋亡执行蛋白caspase-3被活化，证实创伤可诱导心肌细胞凋亡。
为了观察创伤后ERS的发生情况，我们对ERS标志分子进行检测。GRP78是内质网分子伴侣蛋白，通常以其表达增高作为ERS发生的标志[13]；而ATF6、IRE1α和PERK是内质网膜蛋白，是ERS的传感器，过度ERS时，GRP78与ATF6、IRE1α和PERK解离，进而激活这3个传感器[14]。本研究结果表明，创伤导致GRP78的解离及ATF6、IRE1α和PERK的激活，引起ERS的发生。为了进一步探讨创伤是否激活ERS凋亡途径，我们对ERS凋亡相关蛋白CHOP及caspase-12进行检测。CHOP由内质网膜蛋白PERK和ATF6共同激发[15,16];caspase-12的活化是由内质网膜蛋白IRE1α磷酸化触发的[14]。本研究结果显示，CHOP及caspase-12在创伤后表达水平显著上调，推测创伤引起的大鼠心肌细胞凋亡可能与ERS凋亡途径的激活有关。
图3创伤后不同时点ERS相关凋亡蛋白CHOP和caspase-12在大鼠心肌组织中的表达和活性水平
图4 ERS抑制剂4-PBA处理对ERS相关凋亡蛋白CHOP表达和caspase-12活化的影响
图5 ERS抑制剂4-PBA处理对创伤大鼠心肌组织caspase-3活化的影响
为了进一步明确ERS凋亡途径的激活对创伤致大鼠心肌细胞凋亡的作用，我们给予创伤大鼠ERS抑制剂4-PBA处理[17]，结果显示，抑制ERS可降低ERS相关凋亡蛋白CHOP和caspase-12的表达，阻断ERS凋亡途径；也可下调凋亡执行蛋白caspase-3的活性。以上结果证实创伤引起的大鼠心肌细胞凋亡是ERS凋亡途径激活所致。
综上所述，本研究显示创伤早期可诱发大鼠心肌组织ERS的产生，进而激活ERS凋亡通路，最终导致细胞凋亡。这为TISCI的发病机制提供了新的实验依据。
参考文献：
[4]郑璐,韩冰,汤雷,等.内质网应激诱导的自噬对肝细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2019,35(2):332-339.
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于雪娇,何金玲,杨博文,焦向英,曹济民,贺忠梅,燕子.内质网应激在创伤致大鼠心肌细胞凋亡中的作用[J].中国病理生理杂志,2020,36(07):1237-1242.
基金:国家自然科学基金资助项目(No.81500185);首都医科大学代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室开放研究课题(No.2014DXWL04);山西医科大学创新基金资助项目(No.01201311);山西省“1331工程”重点学科建设计划项目
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期刊名称：心脏杂志
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主管单位：第四军医大学
主办单位：第四军医大学,中国老年保健医学研究会心脏学会,中国医药信息学会心功能学会,陕西省生理科学会
出版地方：陕西
专业分类：医学
国际刊号：61-1268/R
国内刊号：61-1268/R
邮发代号：52-131
创刊时间：1989年
发行周期：双月刊
期刊开本：大16开
见刊时间：10-12个月
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2020-08-07
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