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灯盏花乙素抑制人前列腺癌细胞系PC-3的增殖和迁移

2024-09-03 44 上传者：管理员

摘要：目的探讨灯盏花乙素（STR）对人前列腺癌细胞系（PC-3）增殖、迁移的影响及其作用机制。方法 PC-3细胞分为STR低、中和高剂量组、colivelin（STAT3激活剂）组、STR高剂量+colivelin组、对照组。CCK-8法、集落形成实验检测细胞增殖；划痕实验检测细胞迁移；透射电镜观察细胞线粒体超微结构；比色法检测细胞内游离Fe2+、丙二醛（MDA）含量及活性氧（ROS）水平；RT-qPCR检测溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA表达；Western blot检测p-STAT3、GPX4蛋白。结果与对照组对比，STR低、中和高剂量组细胞线粒体结构破坏明显，A450值、集落形成率、划痕愈合率、PCNA、SLC7A11、MMP-9 mRNA表达及p-STAT3、GPX4蛋白降低（P<0.05）,Fe2+、MDA含量及ROS水平升高，且呈剂量依赖性（P<0.05）;与对照组相比，colivelin组细胞中线粒体结构破坏有所改善，A450值、集落形成率、划痕愈合率、PCNA、SLC7A11、MMP-9 mRNA表达及p-STAT3、GPX4蛋白升高，Fe2+、MDA含量及ROS水平降低（P<0.05）;与STR高剂量组相比，STR高剂量+colivelin组细胞中线粒体结构破坏有所减轻，A450值、集落形成率、划痕愈合率、PCNA、SLC7A11、MMP-9 mRNA表达及p-STAT3、GPX4蛋白升高，Fe2+、MDA含量及ROS水平降低（P<0.05）。结论 STR降低和减弱前列腺癌细胞增殖和迁移能力，其机制可能与抑制STAT3/GPX4通路有关。

关键词：
GPX4
信号转导子和转录激活子3/谷胱甘肽过氧化物酶4信号通路
前列腺癌
灯盏花乙素
铁死亡
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前列腺癌(prostate cancer)的发病率在世界范围内显著增加。2020年，全球有141.43万例患者被诊断为前列腺癌，37.53万例患者死亡[1]。迄今为止，雄激素剥夺疗法是晚期和转移性前列腺癌患者的关键治疗方法，但此种方法的长期使用可使大多数患者对雄激素剥夺疗法耐药，最终发展为去势抵抗性前列腺癌[2]。因此，迫切需要确定新的治疗药物抑制前列腺癌进展。灯盏花乙素(scutellarin, STR)又称黄芩素(baicalein),是黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi.)的有效活性成分，具有抗感染、抗肿瘤等作用[3]。研究发现，诱导铁死亡可延缓前列腺癌恶性进展[4];且抑制信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)通路促进铁死亡可抑制胰腺癌细胞增殖[5]。上述研究提示调节STAT3/GPX4通路诱导肿瘤细胞铁死亡可能是抑制前列腺癌恶性进展的重要策略。但STR能否通过调节STAT3/GPX4通路诱导铁死亡进而抑制前列腺癌恶性进展尚不可知。基于此，本研究主要探究STR对前列腺癌细胞增殖、迁移的影响以及机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：

人前列腺癌细胞系PC-3(武汉尚恩生物公司)。

1.1.2 主要试剂：

灯盏花乙素(又名野黄芩苷，黄芩素，纯度>98%,成都埃法生物公司；STAT3激活剂colivelin(MCE公司);八肽胆囊收缩素(cholecysto-kinin octapeptide, CCK-8)试剂盒(弗元生物科技公司);铁离子比色法检测试剂盒(绍兴美迪康生物技术公司);活性氧(reactive oxygen species ,ROS)检测试剂盒(武威联硕生物公司);丙二醛(malonaldehyde, MDA)试剂盒(北京百奥莱博科技公司);兔源一抗STAT3、p-STAT3、GPX4、GAPDH及羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组：

取PC-3细胞分为对照组(用PBS处理48 h)、STR低、中和高剂量组(分别用200、400和600 μmol/L STR处理48 h)、colivelin组(用0.5 μmol/L colivelin处理48 h)、STR高剂量+colivelin组(用600 μmol/L STR和0.5 μmol/L colivelin共同处理48 h)。处理后用于研究。

1.2.2 CCK-8法检测PC-3细胞增殖：

将PC-3细胞置于96孔板(1×104个/孔)中，加入10 μL CCK-8孵育2 h。测量450 nm处A值。

1.2.3 集落形成实验检测PC-3细胞增殖：

将PC3细胞(500个/孔)置于6孔板中孵育2周。所得集落用10%甲醇固定、1%结晶紫染色。计数可见集落形成情况。

1.2.4 划痕实验检测PC-3细胞迁移：

PC-3细胞在6孔板中培养24 h后已达到适宜的汇合度，改为无血清培养基培养细胞，用200 μL移液器尖端在细胞层上划痕。并于划痕0 h、48 h时采集图像，用ImageJ软件分析划痕愈合情况。

1.2.5 透射电镜观察PC-3细胞线粒体超微结构：

制备PC-3细胞爬片后用醋酸二氧六环铀[UO2(CH3COO)22H2O)]和柠檬酸铅(C6H5O7Pb)染色细胞爬片。观察细胞线粒体的超微结构变化[电镜使用电压500 KV,放大倍数(×40 000)]。

1.2.6 细胞内游离Fe2+含量的检测：

收集细胞裂解液裂解细胞的细胞上清，并与工作液在60 ℃下孵育1 h, 再加入30 μL Fe2+检测剂孵育30 min, 在570 nm波长处测量反应后的溶液的吸光度值，并以对照组均值为基准计算各组游离Fe2+水平。

1.2.7 细胞内MDA含量的检测：

在95 ℃的酸性条件下将硫代巴比妥酸与PC-3细胞共孵育40 min, 测量450 nm波长下的吸光度值。MDA测量值以nmol/mg细胞蛋白表示。

1.2.8 细胞内ROS水平的检测：

将2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯稀释剂与PC-3细胞悬液混匀，37 ℃下孵育30 min。细胞洗涤3次后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀再重悬于PBS。用流式细胞仪分析ROS水平。

1.2.9 实时荧光定量PCR仪(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测PCNA、SLC7A11、MMP-9 mRNA表达：

Trizol试剂提取PC-3细胞总RNA。通过nanodrop超微量分光光度计检测分离的RNA浓度。将RNA反转录为cDNA后进行RT-qPCR反应。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP)-9、mRNA的表达以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt法计算。引物：GAPDH正向：5′-TCTCTGATTT GGTCGTAT-3′,反向：5′-TTGATGGCAACAATATCC-3′;PCNA正向：5′-TGCCATATTGTCACTCCTTCTA-3′,反向：5′-CATTGCGTATTTGTCCTCCTT-3′;MMP-9正向：5′-AACTGGTATTCTGTTCTG-3′,反向：5′-GGT TAGAGAATCCAAGTT-3′;SLC7A11正向：5′-ACTC CTTCCTTCCTTAGCATAG-3′,反向：5′-TCT TACCTC CAGCAACATATCA-3′。

1.2.10 Western blot检测p-STAT3、GPX4蛋白：

RIPA裂解缓冲液提取PC-3细胞总蛋白质。蛋白质经定量、分离、转移PVDF膜、封闭1 h后，与一抗p-STAT3(1∶3 000)、STAT3(1∶4 000)、GAPDH(1∶3 000)、GPX4(1∶2 000)在4 ℃下孵育过夜，再与二抗(1∶5 000)孵育1 h, ECL试剂观察蛋白质条带。ImageJ软件量化蛋白质灰度值。

1.3 统计学分析

用SPSS 25.0行统计分析，数据以均数±标准差

表示，单因素方差分析及事后SNK-q检验用于多组间的比较。

2、结果

2.1 灯盏花乙素对PC-3细胞增殖的影响

与对照组相比，STR呈剂量依赖性抑制PC-3细胞A450值、集落形成率(P<0.05);Colivelin组A450值、集落形成率高于对照组(P<0.05);STR高剂量+colivelin组A450值、集落形成率高于STR高剂量组(P<0.05)(图1)。

图1 PC-3细胞的A450值、集落形成率变化

2.2 灯盏花乙素对PC-3细胞迁移的影响

与对照组相比，STR呈剂量依赖性抑制PC-3细胞划痕愈合率(P<0.05);与对照组相比，colivelin组划痕愈合率升高(P<0.05);与STR高剂量组相比，STR高剂量+colivelin组划痕愈合率升高(P<0.05)(图2)。

图2 PC-3细胞的划痕愈合率变化比较

Fig 2 Comparison of changes in scratch healing rate of PC-3 cells

2.3 灯盏花乙素对PC-3细胞线粒体超微结构的影响

与对照组相比，STR低、中和高剂量组PC-3细胞中线粒体萎缩，颜色变深，线粒体内嵴明显破坏，外膜部分破裂等；与对照组相比，colivelin组线粒体结构破坏有所改善；与STR高剂量组相比，STR高剂量+colivelin组线粒体结构破坏有所减轻(图3)。

图3 透射电镜观察PC-3细胞中线粒体结构变化

2.4 灯盏花乙素对PC-3细胞中Fe2+、MDA含量及ROS水平的影响

与对照组相比，STR呈剂量依赖性增加PC-3细胞中Fe2+、MDA含量及ROS水平(P<0.05);与对照组相比，colivelin组Fe2+、MDA含量及ROS水平降低(P<0.05);与STR高剂量组相比，STR高剂量+colivelin组Fe2+、MDA含量及ROS水平降低(P<0.05)(图4)。

图4 PC-3细胞中Fe2+、MDA含量及ROS水平变化比较

2.5 灯盏花乙素对PC-3细胞中PCNA、MMP-9、SLC7A11 mRNA表达的影响

与对照组相比，STR呈剂量依赖性降低PC-3细胞中PCNA、MMP-9、SLC7A11 mRNA表达(P<0.05);colivelin组PCNA、MMP-9、SLC7A11 mRNA高于对照组(P<0.05);STR高剂量+colivelin组PCNA、MMP-9、SLC7A11 mRNA高于STR高剂量组(P<0.05)(图5)。

图5 PC-3细胞中PCNA、MMP-9、SLC7A11 mRNA表达及p-STAT3、GPX4蛋白表达变化比较

2.6 灯盏花乙素对PC-3细胞中STAT3/GPX4通路蛋白表达变化的影响

与对照组相比，STR呈剂量依赖性降低PC-3细胞中p-STAT3、GPX4蛋白(P<0.05);与对照组相比，colivelin组p-STAT3、GPX4蛋白升高(P<0.05);与STR高剂量组相比，STR高剂量+colivelin组p-STAT3、GPX4蛋白升高(P<0.05)(图5)。

3、讨论

前列腺癌是男性中诊断最多的癌，在世界范围内造成了沉重的社会和经济负担，尽管治疗策略取得了进步，但转移性前列腺癌患者的预后仍然不容乐观[6]。因此，寻找新的治疗药物意义重大。

STR作为一种类黄酮，其具有抗菌、抗病毒和抗癌等特性[7]。已有研究报道，黄芩素可抑制人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖[8]。本研究以人前列腺癌细胞系PC-3为研究对象，结果显示，STR可呈剂量依赖性地抑制PC-3细胞增殖与迁移。PCNA是参与DNA复制的重要因子，其是细胞增殖的常见标志蛋白[9];MMP-9可通过降解细胞外基质的方式增强细胞迁移行为[10]。本研究中STR可呈剂量依赖性地下调PC-3细胞中PCNA、MMP-9 mRNA,这从分子水平上表明了STR对PC-3细胞增殖与迁移行为的抑制作用。提示STR可能成为治疗前列腺癌的潜在有效药物之一。

大量研究表明，铁死亡与癌的发生和进展有关[11]。已有研究表明，抑制铁死亡促进前列腺癌细胞增殖和侵袭[12],提示靶向调控铁死亡可能是抑制前列腺癌恶性进展的关键。铁死亡作为一种新型的细胞死亡形式，许多因素直接或间接地促进铁死亡的发生。生化上，细胞内铁超载、ROS、MDA积累等均导致铁死亡[13];在微观结构上，铁死亡通常与线粒体体积减少、双层膜密度增加以及线粒体嵴减少或消失有关；在遗传水平上，SLC7A11是一种多通道跨膜蛋白，介导系统中胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白活性，并调节谷胱甘肽合成以影响铁死亡[14]。本研究显示，STR可呈剂量依赖性地破坏PC-3细胞线粒体超微结构，升高PC-3细胞中Fe2+、MDA含量、ROS水平，降低SLC7A11 mRNA表达，提示STR对PC-3细胞增殖与迁移行为的抑制作用可能与诱导PC-3细胞铁死亡有关。

STAT3介导多种基因的表达以响应细胞刺激，据报道，激活的STAT3可调节GPX4表达，而GPX4可通过将脂质氢过氧化物转化为无毒的脂醇来防止铁死亡。已有研究报道，抑制STAT3/GPX4通路可诱导肝癌细胞铁死亡进而减弱肝癌细胞的侵袭和迁移[15]。本研究显示，STR可呈剂量依赖性地抑制PC-3细胞中p-STAT3、GPX4蛋白表达，推测STR可能通过抑制STAT3/GPX4通路减弱前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。Colivelin是STAT3通路的有效激活剂，为了验证该推测，本研究用高剂量STR和colivelin处理PC-3细胞，结果显示，colivelin降低了高剂量STR对PC-3细胞铁死亡、增殖及迁移的影响。证实了猜想是合理的。

综上所述，STR可能通过抑制STAT3/GPX4通路降低和减弱前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。

参考文献:

[4]穆克飞,叶纪伟,沈远径,等.小檗碱诱导前列腺癌细胞铁死亡及其作用机制[J].中国癌症防治杂志,2023,15:278-284.

[6]刘彼得,李循,王书恒,等.miR-146a-5p靶向SMAD4抑制人前列腺癌细胞系PC-3增殖和侵袭[J].基础医学与临床,2023,43 :1215-1221.

[8]史乃旭,郝苗,张天夫,等.黄芩素对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖的抑制作用及其机制[J].吉林大学学报(医学版),2023,49:985-993.

[11]蔡月红,麦燕,钱沁佳.EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡[J].现代肿瘤医学,2023,31:4326-4333.

[12]赵军,毛亮,沈继杰,等.癌相关成纤维细胞外泌体通过抑制铁死亡促进前列癌恶性侵袭[J].中国肿瘤外科杂志,2023,15:133-140.

[13]张鹏,葛亮,孔令国,等.咪达唑仑通过调节Nrf2/HO-1信号通路对宫颈癌细胞铁死亡的作用及机制研究[J].实用医学杂志,2023,39:1740-1745.

基金资助:重庆市科学技术局(超声医学工程国家重点实验室)项目(2021KFKT018);

文章来源:肖艳红,姜明东,林叶远,等.灯盏花乙素抑制人前列腺癌细胞系PC-3的增殖和迁移[J].基础医学与临床,2024,44(09):1229-1235.