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基于Caspase3通路探究敲低miR-6861-5p对乳腺癌细胞凋亡和侵袭的影响

2023-06-28 79 上传者：管理员

摘要：目的探讨通过Caspase3通路分析敲低miR-6861-5p对乳腺癌细胞凋亡和侵袭的影响。方法购买乳腺癌细胞株T47D常规培养至对数时期，分装6个孔板1.5×106个孔中，随机分为3组，分为空白组、过表达组及敲低组，每组5个复孔，等待细胞贴壁生长分别用磷酸盐缓冲液(PBS)干预进行细胞培养和miR-6861-5p转染。过表达组转染si-6861-5p-NC质粒，敲低组转染si-6861-5p质粒，空白组细胞不进行处理，转染24 h后鉴定转染效率。比较干预24 h、48 h及72 h细胞增殖、凋亡及抑制率，细胞迁移、侵袭情况；检测细胞Caspase3通路蛋白表达状况。结果过表达组miR-6861-5p表达量为(2.42±0.86),空白组miR-6861-5p表达量为(1.52±0.43),敲低组miR-6861-5p表达量为(0.75±0.12),3组间比较，差异有统计学意义(F=4.440,P<0.05)。过表达组miR-6861-5p表达量高于空白组，差异有统计学意义(t=2.093,P<0.05);敲低组miR-6861-5p表达量低于过表达组，差异有统计学意义(t=4.300,P<0.05);敲低组miR-6861-5p表达量低于空白组，差异有统计学意义(t=3.857,P<0.05)。过表达组细胞增殖率、迁移数、侵袭数及MMP2蛋白表达量均高于空白组，细胞凋亡率、Bcl-2、Bax、Cyt-c及Caspase3蛋白表达量均低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05);敲低组细胞增殖率、细胞迁移数、侵袭数及MMP2蛋白表达量低于空白组，细胞凋亡率、Bax、Bcl-2、Cyt-c及Caspase3蛋白表达量均高于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论敲低miR-6861-5p可促进乳腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移及侵袭，其作用影响可能与Caspase3信号通路相关。

关键词：
Caspase3通路
乳腺癌
细胞侵袭
细胞凋亡
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在全球女性癌症中的发病率为24%。近年来，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，位居女性癌症首位[1,2]。乳腺癌早期的症状不明显，晚期可发生癌细胞转移，出现全身多器官病变威胁患者的生命[3,4]。临床常用的治疗方法包括放疗、化疗及手术治疗，手术治疗是主要治疗手段之一。由于乳腺癌的病因尚不清晰，目前尚未找到乳腺癌确切致癌原因，所以早诊治、早治疗，寻找新的治疗靶点和有效药物探究其对乳腺癌细胞凋亡和侵袭机制是乳腺癌患者生存的关键[5,6]。微小RNA(microRNA)是一类长度为22个碱基的小非编码RNA,通过与靶序列结合调节靶基因的转录和表达。张强和朱文龙等[7,8]研究显示，miRNA的表达与乳腺癌的发生、发展具有密切关系，通过miRNA的表达评估乳腺癌成为研究的热点。基于上述研究背景，本研究探讨miR-6861-5p对乳腺癌细胞凋亡、侵袭及Caspase3通路的影响，旨在为临床乳腺癌的研究提供新的方向。现将研究结果报道如下。

1、对象与方法

1.1研究对象

研究细胞：乳腺癌细胞株T47D购自上海冠导生物工程有限公司。本文研究已获得本院伦理委员会批准。主要试剂：miR-6861-5p过表达转染质粒(si-miR-6861-5p-NC),miR-6861-5p敲低(si-miR-6861-5p)转染质粒，由上海吉玛公司设计并合成；兔抗人Bax、小鼠抗大鼠Bcl-2抗体购自北京百奥莱科技有限公司；兔抗人MMP-2购自艾美捷科技有限公司；兔抗大鼠Cyt-c、Caspase3购自上海酶联生物研究所。

1.2方法

1.2.1细胞培养

将购买的人乳腺癌细胞株T47D放置于用含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中，在温度为37℃、5%CO2的条件下培养箱中培养。定期观察细胞生长情况，培养至对数时期时，调整细胞密度1.5×106个孔，分装6孔板中随机分为3组，每组5个复孔(一部分放入盖玻片)等待细胞壁生长，分别用磷酸盐缓冲液(PBS)进行处理，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2细胞miR-6861-5p转染

取对数时期的人乳腺癌细胞株T47D,将细胞分为空白组、过表达组及敲低组。采用GenBank查找序列获得miR-6861-5p序列，构建miR-6861-5p过表达转染质粒(si-miR-6861-5p-NC)、miR-6861-5p敲低(si-miR-6861-5p)转染质粒，由上海吉玛公司设计合成，参照Lipofectamine2000说明书行转染操作，过表达组转染si-miR-6861-5p-NC质粒，敲低组转染si-miR-6861-5p质粒，转染24 h行后续试验，空白组细胞不进行处理。

1.2.3转染效率鉴定

在转染24 h后使用实时荧光定量PCR法测定miR-6861-5p转染效率。取培养至72 h乳腺癌细胞株T47D,离心，去上清，应用Trizol法提取组织中总RNA,提取后测定所提取RNA的含量和纯度，将mRNA逆转录试剂盒行逆转录获得cDNA,使用RT-PCR方法检测miR-6861-5p mRNA表达量，采用2-△△Ct方法计算。反应条件：94℃5 min; 94℃60 s, 61℃40 s, 72℃5 min,重复30个循环。以β-actin为内参对照物。miR-6861-5p引物序列：上游5'ACACTCCAGCTGG-GACTGGTAGGTGGGC-3',下游5'GTGCAGGGTC-CGAGGT-3',U6上游引物为U6-F:CTCGCTTCGGCAGCA-CA,下游引物为AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4细胞增殖检测

使用MTT比色法测定，将测定的细胞浓度调整为3×104个/ml,然后将测定的细胞在96孔板中接种，各孔中加入细胞悬液200μl,在环境为37℃、5%CO2中培养24 h、48 h及72 h,加入10μl MTT试剂，孵育4 h,使用酶标仪测定OD值，评价细胞增殖抑制情况。

1.2.5细胞凋亡检测

使用TUNEL法检测细胞凋亡，将培养细胞行浸洗、固定及封闭，进行标记滴加显色液，复燃细胞核出现蓝色荧光(隐形细胞数)、绿色荧光(阳性细胞数),使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6细胞迁移检测

使用划痕实验测定细胞迁移能力，将培养细胞在19孔板上接种，待至细胞生长80%,采用100μl枪头做垂直划直线，再使用PBS洗涤，重复3次，使用0.5%血清培养24 h后用倒置显微镜查看细胞迁移状况。

1.2.7细胞侵袭检测

使用Transwell小室测定细胞侵袭，将培养的细胞放置Transwell小室中，上室接种细胞悬液，下室接种IL-8(100 ng/ml),1 d后，下室加TMP溶液，孵育180 min左右，将上室微孔中细胞擦拭，使用BS洗涤，4%多聚甲醛溶液固色15 min,苏木晶染色、PBS清晰，使用倒置显微镜观察细胞侵袭情况。

1.2.8细胞Caspase3通路蛋白检测

使用Western Blot法检测细胞Caspase3通路蛋白表达情况，提取培养细胞蛋白、离心，应用BCA进行蛋白定量测定，将2×SDS凝胶缓冲液中加入50μg蛋白，做电泳1.5 h后封闭处理，将1∶1 000比例的TBST稀释分别加入Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase3、MMP2一抗，在4℃环境中过夜孵育，TBST 3次洗膜，将1∶10 000 TBST稀释二抗加入，摇动孵育60 min, TBST 3次洗膜，DAB显色。了解蛋白表达水平，用GAPDH做蛋白内参。

1.3统计学分析

运用SPSS 19.0软件处理数据。用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料使用(x¯±s)进行描述，组间两两比较采用独立t检验，计数资料以[例(%)]表示，多组间行F值数据计算，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 3组细胞miR-6861-5p表达量比较

过表达组miR-6861-5p表达量为(2.42±0.86),空白组miR-6861-5p表达量为(1.52±0.43),敲低组miR-6861-5p表达量为(0.75±0.12),3组间比较，差异有统计学意义(F=4.440,P<0.05)。过表达组miR-6861-5p表达量高于空白组，差异有统计学意义(t=2.093,P<0.05);敲低组miR-6861-5p表达量低于过表达组，差异有统计学意义(t=4.300,P<0.05);敲低组miR-6861-5p表达量低于空白组，差异有统计学意义(t=3.857,P<0.05)。表示miR-6861-5p转染成功。

2.2 3组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭情况比较

过表达组细胞增殖率高于空白组，细胞凋亡率低于空白组，敲低组细胞增殖率低于空白组，细胞凋亡率高于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。过表达组细胞迁移数、侵袭数高于空白组，敲低组细胞迁移数、侵袭数低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。3组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭情况比较见表1。细胞凋亡、侵袭及迁移图见图1～3。

2.3 3组细胞Caspase3通路蛋白表达量比较

过表达组Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase3蛋白表达量低于空白组，MMP2蛋白表达量高于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05);敲低组Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase3蛋白表达量高于空白组，MMP2蛋白表达量低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。3组细胞Caspase3通路蛋白表达量比较见表2,Caspase3通路蛋白WB图见图4。

表1 3组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭情况比较(x¯±s)

图1细胞凋亡图(TUNEL法，×10)

图2细胞侵袭图(苏水晶染色，×10)

图3细胞迁移图(×10)

图4 Caspase3通路蛋白WB图

3、讨论

乳腺癌是一种上皮细胞发生增殖失控而发生恶变的疾病，发病率占女性肿瘤首位，随着新的治疗方法的普及，乳腺癌死亡率逐渐下降，但在广大农村地区乳腺癌死亡率下降趋势并不明显。乳腺癌疾病的发生进展与癌细胞的凋亡、侵袭密切相关[9,10]。常用化疗药物会产生胃肠道、骨髓抑制及肝肾功能等不良反应，治疗效果不理想。因此，寻找新的治疗靶点和有效药物对乳腺癌的治疗有重大意义[11,12]。

随着临床对microRNA的进一步研究发现，其在一定程度上影响癌细胞凋亡、侵袭，miR-6861-5p属于microRNA的一种，microRNA是一类长度为22个碱基的小非编码RNA,通过与靶序列结合调节靶基因的转录和表达，在血清中被认为是最具代表的肿瘤生物标志物，在多种乳腺癌的研究中miRNA被证实可用于临床诊断[13,14]。miR-6861-5p是近研究新发现的microRNA,据相关研究表明，miR-6861-5p不仅可参加肿瘤血管内皮细胞的产生，协助肿瘤分泌细胞因子导致激活纤溶酶原，加强了肿瘤的迁移动力；即在乳腺癌组织中表达高于癌旁正常组织和良性病变组织，又在良性病变组织和癌旁组织表达中水平无明显差异，说明乳腺癌组织中miR-6861-5p的高表达说明乳腺癌是血清学诊断标志物并可能是乳腺癌发生的重要因素之一[15,16]。本研究对乳腺癌细胞miR-6861-5p进行敲低处理，结果显示，经miR-6861-5p敲低后，miR-6861-5p表达在无淋巴结转移者血清中表达低于有淋巴结转移者，提示miR-6861-5p的表达可能与淋巴结转移和疾病发展相关。

Caspase3是白细胞介素1-β转化酶家族成员之一，在细胞凋亡中Caspase3家族占重要核心地位，是该家族级联反应下游的关键酶凋亡过程中关键因子，可诱导细胞促进凋亡、抑制侵袭，是细胞死亡的形式之一[17,18]。Caspase3是细胞凋亡的死亡关键蛋白酶，在多种蛋白水解酶作用下被激活。肿瘤侵袭和转移具有复杂性，细胞外基质具备天然屏障，MMPs能够降解细胞外基质，细胞MMP2与细胞侵袭转移有关，据研究[19,20]发现，抑制MMP2的表达能够降低癌细胞的侵袭能力。Bcl-2、Bax的过度表达与Cyt-c的释放、Caspase3蛋白酶的活化介导细胞的存活和衰亡密不可分。细胞发生凋亡和侵袭的是Caspase效应被激活使细胞内的靶物质被水解，细胞内蛋白被降解，导致细胞走向不可逆死亡[21]。随研究进一步分析发现，激活Caspase3可使血管内皮细胞凋亡、侵袭。miR-6861-5p的表达对一些关键信号通路发挥重要作用，参与细胞凋亡、侵袭，是检测乳腺癌患者乳腺癌复发的潜在生物标志物。本研究结果显示，通过Western Blot检测MMP2、Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase3及信号的表达，发现敲低组Bax、Bcl-2、Cyt-c及Caspase3表达升高，MMP2表达降低，说明敲低组miR-6861-5p细胞可通过抑制Caspase3信号影响乳腺癌的进展，通过调节MMP2的表达来影响细胞的凋亡和侵袭。基于前期生物学数据分析Caspase3信号通路与乳腺癌细胞中miR-6861-5p的生长、凋亡及侵袭等功能相关。本研究中进一步分析敲低miR-6861-5p对乳腺癌细胞凋亡、侵袭的作用功能，结果显示，干预后Caspase3信号通路被敲低miR-6861-5p抑制，并激活Caspase3信号通路促进细胞凋亡和抑制侵袭。

综上所述，乳腺癌细胞中miR-6861-5p高表达，敲低miR-6861-5p处理可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡，其作用机制可能与激活Caspase3信号通路有关，经调控Bax、Bcl-2、Cyt-c及Caspase3表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，经调控MMP2表达抑制细胞迁移、侵袭。

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文章来源：王智颖,王佳智.基于Caspase3通路探究敲低miR-6861-5p对乳腺癌细胞凋亡和侵袭的影响[J].中国妇幼保健,2023,38(13):2453-2457.