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FASN对乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移的影响

2025-08-12 55 上传者：管理员

摘要：目的脂肪酸合成酶(FASN)对乳腺癌细胞上皮间质转化和迁移的影响。方法通过细胞转染实验，镜下观察FASN过表达的乳腺癌细胞株MCF-7细胞的形态学改变；实验分为FASN沉默(FASN-siRNA)组及其相对应的转染对照(NC-siRNA)组、FASN过表达(FASN-pcDNA)组及其相对应的转染对照(NC-pcDNA)组。采用划痕试验，观察MCF-7和正常人乳腺细胞株MCF10-A细胞因FASN沉默及过表达载体对细胞迁移的影响；采用Western印迹检测MCF-7细胞上皮标记蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、上皮-间质转化(EMT)相关转录因子锌指转录因子(Snail)和间质标志蛋白波形蛋白(vimentin)在转染后的表达。结果镜下可见转染对照组MCF-7细胞为铺路石样，相对较小，而FASN过表达的细胞解离，呈梭形变长。转染24 h后FASN-pcDNA组的MCF-7及MCF10-A细胞划痕愈合率及迁移能力明显高于NC-pcDNA组，FASN-siRNA组MCF-7、MCF10-A细胞划痕愈合率及迁移能力明显低于NC-siRNA组(P<0.05)。FASN-pcDNA组中vimentin、snail蛋白表达明显高于NC-pcDNA组，E-cadherin蛋白表达明显低于NC-pcDNA组(P<0.05)。结论 FASN能促使乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移。

关键词：
上皮间质
乳腺癌细胞
恶性细胞
恶性肿瘤
脂肪酸合成酶
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乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,在正常乳腺细胞转变成恶性细胞并发生转移过程中,细胞间黏附降低,从而表现出一种有益于恶性细胞变动的表型并摆脱周围组织的约束｡当上皮细胞受到环境刺激时,就会拥有间质表型和功能,此过程称为上皮⁃间质转化(EMT),即正常组织变换成恶性肿瘤组织;整齐排列并且具有极性的上皮细胞失去黏附性,变换成具有活动本领并且不稳定的梭形间质细胞的过程｡重要分子转换表达在EMT过程中就是钙黏蛋白(cadherin)的异常表达,其中在肿瘤转移过程中最具代表性的两种类型为间质标志物波形蛋白(vimentin)及上皮标志物E⁃cadherin,EMT过程中的关键调控因子为锌指转录因子(Snail)｡E⁃cadherin在维持细胞间连接中起重要作用｡EMT最重要的标志性变化体现在当恶性肿瘤发生发展时及上皮细胞发生间质细胞转化时发生E⁃cadherin下调或功能紊乱;E⁃cadherin表达减低或丧失使得肿瘤细胞之间紧密连接消失,促使拥有向远处侵袭转移的本领｡在肿瘤中,EMT后,细胞获得渗透和转移的能力并产生耐药性,导致患者预后不良〔1~3〕｡研究发现,EMT增加了脂肪酸合成酶(FASN)在其组织中的表达〔4〕｡另一项研究发现,降低FASN酶活性可以降低跨膜蛋白CD44表达,削弱下游肝细胞生长因子受体(c⁃MET)信号传导,并预防裸小鼠肿瘤转移〔5〕｡相反,上皮细胞中FASN过表达的不朽性可能促进裸小鼠侵袭性腺癌的发展〔6〕｡本研究探讨FASN对乳腺癌细胞EMT和迁移中的作用机制｡

1、材料与方法

1.1实验细胞及主要试剂正常人乳腺细胞株MCF10⁃A及人乳腺癌细胞株MCF⁃7(ATCC有限公司);高糖培养基(干粉)和Opti⁃MEMI培养基(Gib⁃co公司);胞牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰酶(Sigma公司);Lipofectamine2000转染剂､siRNA､DNA(武汉珈创生物技术股份有限公司)｡兔抗人FASN､E⁃cadherin､Snail和vimentin单克隆抗体(CellSignaling公司);鼠抗兔FASN多克隆抗体(江苏康为世纪生物科技股份有限公司);电化学发光(ECL)显色试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);TrizolRNA总提取试剂〔天根生化科技(北京)有限公司〕｡

1.2细胞培养用含有15%胎牛血清的高糖DMEM培养基贴壁培养MCF10⁃A与MCF⁃7细胞,并置于5%CO2的饱和湿度培养箱中37℃培养｡

1.3细胞转染实验MCF⁃7和MCF10⁃A细胞转染前1d接种细胞于24孔板中,转染当天细胞覆盖密度达到60%,然后无双抗培养基培养,空白培养基(无双抗)同步化1h｡同步化过程中配制进行细胞转染用的100μlAB混合液;A液:1μlLipo⁃fectamine2000转染剂稀释于50μl无血清Opti⁃MEMI培养基中,在室温下孵育5min;B液:1μgDNA加入50μlOpti⁃MEMI培养基中｡A液和B液混合获得AB混合液,加入AB混合液(100μl)至不含双抗的培养基(400μl),于24孔板作用,6h后更换完全培养基,镜下观察24h后FASN过表达的MCF⁃7的细胞形态变化,实验分为FASN过表达(FAS⁃pcDNA)组及其相对应的转染对照(NC⁃pcD⁃NA)组｡

1.4细胞划痕实验转染24h后,从24孔板收集MCF⁃7和MCF10⁃A细胞进行划痕实验｡首先,在板的底部做一个标记,然后用移液管尖端垂直于标记做一个划痕｡用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两次以去除分离的细胞,然后用完整的培养基替换｡选择6个视野并在100倍显微镜下拍照,以比较细胞迁移能力和划痕愈合率,细胞用FASN沉默(FASN⁃siRNA组)及过表达(FASN⁃cDNA组)24h,与其相对应的转染对照组(NC⁃siRNA组､NC⁃pcDNA组)相比较｡

1.5Western印迹检测vimentin､E⁃cadherin､Snail蛋白表达提取转染48h后的NC⁃pcDNA组和FASN⁃pcDNA组细胞蛋白,100℃变性6min,每孔加样量30μg,行FASN､E⁃cadherin､vimentin和Snail抗体十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE),用半干转电泳仪电转0.2μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜90min;室温下5ml/L脱脂牛奶封闭液孵育1h,1×TBST洗膜,加入FASN､E⁃cadherin､vim⁃entin和Snail抗体(工作浓度1∶1000),4℃过夜,1×TBST洗膜,在室温下与辣酶根过氧化物酶标记的二抗(工作浓度1∶3000)孵育1h,用β⁃actin作为内参,目的条带用增强型化学发光试剂盒检测｡

1.6统计学方法采用SPSS26.0软件进行配对t检验｡

2、结果

2.1观察FASN过表达的乳腺癌MCF⁃7细胞形态学镜下可见NC⁃pcDNA组MCF⁃7细胞为铺路石样,相对较小,而FASN⁃cpDNA组细胞解离,呈梭形变长｡见图1｡

图1FASN过表达的乳腺癌MCF⁃7细胞的形态改变(免疫组化染色)

2.2FASN过表达对MCF10⁃A､MCF⁃7细胞迁移的调节转染24h后FASN⁃pcDNA组MCF⁃7及MCF10⁃A细胞划痕愈合率及迁移能力明显高于NC⁃pcDNA组(P<0.05);FASNsiRNA组MCF⁃7细胞､MCF10⁃A细胞划痕愈合率及迁移能力明显低于NC⁃siRNA组(P<0.05)｡见表1､图2｡

表1FASN过表达或沉默对MCF10⁃A､MCF⁃7细胞转染24h后划痕愈合率及迁移距离能力的影响(x±s,n=6)

图2FASN沉默､FASN过表达对MCF10⁃A､MCF⁃7细胞迁移的影响(×200)

2.3FASN过表达对乳腺癌细胞MCF⁃7EMT蛋白的影响FASN⁃pcDNA组中vimentin､snail蛋白表达明显高于转染NC⁃pcDNA组,E⁃cadherin蛋白表达明显低于NC⁃pcDNA组(P<0.05)｡见图3､表2｡

图3FASN过表达的MCF⁃7细胞E⁃cadherin､FASN､vimentin､snail1表达

表2FASN过表达的MCF⁃7细胞E⁃cadherin､FASN､vimentin､snail1蛋白表达(x±s,n=6)

3、讨论

研究发现,乳腺癌患者病情恶化和致死的主要原因为EMT,EMT亦是探究乳腺癌发病原理的关键步骤,此导致乳腺癌患者死亡的概率占90%〔7〕｡E⁃cadherin､vimentin是EMT过程中重要的标志物,E⁃cadherin是一种跨膜糖蛋白,在细胞之间起着黏附作用,经过细胞里外粘连,形成α⁃环连蛋白⁃β环连蛋白⁃E⁃cadherin复合体,维持上皮细胞间紧密连接及极性稳定性等功能｡当上皮细胞发生间质细胞表型转化､恶性肿瘤发生发展､远处侵袭转移时常常发现E⁃cadherin表达下调,在肿瘤的发展､侵袭中起负性调控能力｡Vimentin是细胞骨架蛋白,调节细胞增殖､运动,有研究报道,恶性肿瘤细胞的侵袭能力与来源于上皮细胞的肿瘤细胞所表达的vimentin有着密切联系〔8〕｡在肿瘤的侵袭转移中,作为EMT过程中的关键调控因子snail着重要作用;Snail通过上调vimentin及抑制E⁃cadherin表达,可削弱EMT产生｡

细胞发生EMT后有更强大的增殖本领,根据其旺盛代谢依赖于脂肪酸代谢,有研究FASN在发生过EMT的细胞中表达上调;当FASN表达沉默后,细胞EMT发生反方向改变〔9〕｡本研究结果表明,FASN能使乳腺癌细胞发生迁移及EMT｡

研究发现,EMT相关蛋白因肿瘤微环境条件的改变而产生表达｡乳腺癌上皮细胞表型转化因纤连蛋白(fibronectin)及高血糖暴露得到了一个有利的微环境,促使细胞摄取葡萄糖增多,同时导致细胞生长及入侵,这跟文献〔10〕相似｡研究发现,因受高血糖影响的EMT可因FASN沉默而逆转〔11〕｡经FASN阻滞剂浅蓝霉素处理过的过表达有丝分裂蛋白激酶5的MCF⁃7细胞(MCF⁃7⁃MRK5),EMT得到抑制,甚至发生逆转〔12〕｡本文表明,MCF⁃7细胞迁移能力有所提高,与上述研究结果相似｡

尽管一些研究证实,FASN会导致癌症细胞恶化,但在一些肿瘤中也发现了FASN的表达变化,包括癌症〔13〕,这使其被用作预后指标和潜在的治疗靶点〔14,15〕｡研究还发现,浸润性导管癌(IDC)组织中的淋巴结转移和肿瘤大小与脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A⁃FABP)表达有关｡A⁃FABP在大肿瘤和淋巴结转移患者中的阳性表达率较高,其表达与FASN呈正相关〔16〕｡实验表明,将肺癌细胞Ⅱ型肺泡上皮细胞A549注射到FASN稳定退役小鼠体内,导致A549细胞向淋巴结､胸腺和肝脏的转移增加,降低了小鼠存活的可能性〔17〕｡然而,阻断FASN仍然被认为是一种治疗肿瘤的作用,因为它可以抑制细胞生长〔18〕｡

综上,FASN和EMT具有相关性,将乳腺癌的转移跟脂肪酸代谢相互联系,期望在不久的将来能为研究乳腺癌细胞的转移机制贡献新的方法和思路｡

参考文献:

3申梦琴,赵小平,赵丽,等.乳腺癌MCF⁃7细胞通过TGF⁃β诱导的上皮⁃间质转化获得耐药〔J〕.肿瘤,2018;38(4):308⁃17,378.

16周兰,赵玉华,王晓东,等.FASNN和A⁃FABP在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与临床病理学特征的关系〔J〕.四川大学学报(医学版),2015;46(2):228⁃33.

18徐芳华,巢海潮.脂肪酸合成酶在肿瘤发生和发展中的作用研究进展〔J〕.检验医学与临床,2019;16(10):1441⁃4.

基金资助:广西自然科学基金项目(202217);

文章来源:何阳阳,张琴琴,洪勇.FASN对乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移的影响[J].中国老年学杂志,2025,45(15):3723-3726.