信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid, mRNA)是携带遗传信息，并能指导蛋白质合成的一类单链RNA分子。近年随着对其研究的深入，发现无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay, NMD)参与细胞周期和细胞凋亡调节，可能是参与多种恶性肿瘤发生和发展[1]。上游移码蛋白1(Up-frameshift 1,UPF1)是NMD途径的关键因子，其过度磷酸化可促进mRNA降解[2]。既往相关报道显示，UPF1在乳腺癌组织中表达明显上调[3],但其对乳腺癌细胞生物行为以及机制尚未完全明确。上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transformation, EMT)在肿瘤发生和发展过程中有重要作用，是肿瘤转移的标志性事件[4]。近年研究发现，阻断NMD途径有可能成为肿瘤治疗的新方向[5]。乳腺癌作为威胁女性健康的主要恶性肿瘤，虽早期筛查和治疗手段均不断提高，但死亡率居高不下[6,7]。故进一步明确乳腺癌发病机制，寻求更多的治疗靶点，对患者预后以及疾病认识具有重要价值。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与组织

人乳腺癌细胞系AU565及人乳腺上皮细胞系DU4475购于上海宾穗生物科技有限公司。新鲜冰冻乳腺癌组织及正常乳腺组织取自2021年9月—2022年3月本院乳腺切除术43例乳腺癌患者，术前均未进行化疗、放疗或免疫治疗等。

1.1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基：北京伊塔生物科技有限公司。山羊抗人UPF1多克隆抗体：美国Santa Cruz。生物素化山羊抗兔IgG:上海延慕实业有限公司。DAB显色试剂盒(20×)、BCA试剂盒：上海吉至生化科技有限公司。FITC荧光标记二抗：北京博尔西科技有限公司。缓冲甘油封片剂：上海抚生实业有限公司。siRNA-UPF1:上海吉玛制药技术有限公司。E-candherin抗体、Vimentin抗体、N-cadherin抗体：美国Abcam公司。Akt抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、逆转录试剂盒：上海优宁维生物科技股份有限公司。mTOR抗体、β-actin抗体、GAPDH抗体：上海爱必信生物科技有限公司。p-Akt抗体：上海晅科生物科技有限公司。p-mTOR抗体：上海翌圣生物科技股份有限公司。2.5%结晶紫甲醇溶液：北京百奥莱博科技有限公司。超敏ECL化学发光试剂盒：上海源叶生物科技有限公司。无菌PBS溶液、10×TBST溶液(pH8.0):上海恒斐生物科技有限公司。激光共聚焦扫描显微镜：德国Leica公司。凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司。StepOnePlus实时PCR系统：美国ABI公司。倒置显微镜：日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法(Immunohistochemical, IHC)

新鲜冰冻乳腺癌组织及正常乳腺组织制备石蜡块后，置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱水，PBS溶液清洗3次；H2O2溶液室温灭活内源性酶10 min, 蒸馏水冲洗3次；切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液中，高压反应3 min, 冷却20 min后，PBS溶液冲洗3次；滴加5%BSA封闭液，室温反应10 min, 甩去多余液体；滴加山羊抗人UPF1多克隆抗体(1∶300),4 ℃过夜；PBS溶液冲洗3次，每次2 min; 滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶100),37 ℃反应30 min; PBS溶液冲洗3次，每次2 min; 滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素(1∶100),37 ℃水浴30 min; PBS溶液冲洗3次，每次2 min; DAB法显色，镜下观察显色情况；蒸馏水冲洗，苏木素复染2 min, 依次经梯度脱水、透明、封片后，镜下观察，细胞质和/或核上出现棕黄色、棕褐色颗粒即为阳性细胞；Image Pro Plus 6.0软件分析图像，每个切片随机选取3个不重叠视野，测量阳性细胞吸光度(Absorbance, A)值。

1.2.2 激光共聚焦扫描显微镜法(Laser scanning confocal microscope, LSCM)

制备细胞玻片，放入盖片染缸中，PBS溶液振荡洗涤5 min; 吹干，滴加山羊抗人UPF1多克隆抗体，湿盒内4 ℃过夜孵育；PBS溶液冲洗3次，每次5 min; 吹干，滴加FITC荧光标记二抗，37 ℃反应40 min; PBS溶液冲洗3次，每次3 min; 缓冲甘油封片剂封片，激光共聚焦扫描显微镜观察荧光信号，Confocal Sofware软件分析图像，黄绿色荧光为阳性信号，随机选取10个视野，视野中随机再选取10个阳性表达细胞，计算单个阳性表达细胞中10个光学切片荧光强度(Fluorescence intensity, FI)。

1.2.3 UPF1小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)转染

胰酶消化细胞，将AU565细胞分为siRNA-NC组和siRNA-UPF1组；转染前1 d将细胞接种于96孔板内，37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h; 细胞融合度达80%时，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书操作，分别将siRNA-NC和siRNA-UPF1转染至细胞，置于不含血清及抗生素的DMEM高糖培养基内培养4～6 h; 弃去旧培养基，更换含血清及抗生素的DMEM高糖培养基，继续培养24～48 h, 收集细胞悬液进行后续实验。

1.2.4 蛋白免疫印迹实验(Western boltting, WB)

转染48h后，RIPA法裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；取蛋白样品进行8%SDS-PAGE电泳，电泳结束后湿法转至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭2h, TBST溶液冲洗2次；滴加UPF1抗体、E-钙黏蛋白(E-candherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、N-钙黏蛋白(N-cadherin)抗体、磷酸化-Akt(p-Akt)抗体、p-mTOR抗体、Akt抗体、mTOR抗体(1∶1000),4 ℃过夜孵育；TBST溶液冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶5000),室温反应1 h; TBST溶液冲洗3次，ECL剂发光，凝胶成像系统显影，Image J软件分析蛋白条带。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)

转染48 h后，TRIzol法提取细胞总RNA,测定浓度和纯度；以总RNA为模板将其逆转录为cDNA,StepOnePlus实时PCR系统进行PCR反应，每个样本设置3个复孔，以2-△△Ct法计算转录物相对表达水平。UPF1上游引物5'-CTGCAACGGACGTGGAAATAC-3',下游引物5'-ACAGCCGCAGTTGTAGCAC-3',GAPDH上游引物5'-ATATGTCAAAAATTGGAAT-3',下游引物5'-GCTTAATCTTTAGATTGAAT-3'。

1.2.6 Transwell侵袭实验

提前1 d配置基质胶，均匀铺于Transwell下室；转染48 h后，取对数生长期细胞，胰酶消化，置于无血清的DMEM完全培养基中，调整细胞浓度为2×105个/mL;取200 μL细胞悬液于Transwell上室，700 μL的DMEM完全培养基置于Transwell下室；24 h后，结晶紫甲醇溶液染色10 min, PBS溶液洗去残留液体；倒置显微镜下(20×)观察拍照，每个室取上、下、左、右、中5个视野计数侵入细胞数，取平均值，计算细胞穿膜率。

1.2.7 划痕实验

转染48 h后，取对数生长期细胞；Marker笔在6孔板底部画横线，每孔至少穿过5条线，每条线间距保持一致；以4×105个/孔接种于6孔板内，待细胞铺满板底后，使用20 μL枪头垂直于板底直线划痕，PBS溶液冲洗细胞2～3次，去除划下细胞；更换新的无血清培养基，37 ℃、5%CO2培养箱内培养；分别于0 h、24 h取出细胞，显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野，20×下计数迁移细胞数，取平均值，计算细胞迁移率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布计量资料以表示，两组比较用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 乳腺癌组织及正常乳腺组织中UPF1表达

UPF1在乳腺癌组织细胞浆和细胞核内均有表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒。乳腺癌组织UPF1的A值显著高于正常乳腺组织(P<0.05),见图1。

图1 乳腺癌组织及正常乳腺组织中UPF1表达(IHC,×200)   

2.2 AU565细胞及DU4475细胞中UPF1表达

UPF1在AU565细胞中有绿色荧光表达。AU565细胞UPF1荧光强度显著大于DU4475细胞，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

图2 AU565细胞及DU4475细胞中UPF1表达(LSCM,×200)  

2.3 转染siRNA-UPF1对AU565细胞中UPF1表达的影响

与siRNA-NC组比较，转染siRNA-UPF1后AU565细胞中UPF1蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),见图3。

图3 转染siRNA-UPF1对AU565细胞中UPF1表达的影响   

2.4 沉默UPF1对AU565细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，与siRNA-NC组比较，转染siRNA-UPF1后AU565细胞穿膜率显著增加(P<0.05),见图4。

图4 沉默UPF1对AU565细胞侵袭能力的影响(200×)   

2.5 沉默UPF1对AU565细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与siRNA-NC组比较，转染siRNA-UPF1后AU565细胞迁移率显著增加(P<0.05),见图5。

2.6 沉默UPF1对AU565细胞EMT相关蛋白表达的影响

转染siRNA-UPF1后AU565细胞E-candherin蛋白表达水平显著降低，Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图6。

图5 沉默UPF1对AU565细胞迁移能力的影响(200×)  

图6 沉默UPF1对AU565细胞EMT相关蛋白表达的影响   

2.7 沉默UPF1对AU565细胞Akt/mTOR信号通路的影响

与siRNA-NC组比较，转染siRNA-UPF1后AU565细胞p-Akt和p-mTOR水平显著升高(P<0.05),见图7。

图7 沉默UPF1对AU565细胞Akt/mTOR信号通路的影响   

3、讨论

2022年最新全国癌症统计数据显示，乳腺癌发病率和死亡率均位居女性恶性肿瘤首位[8,9]。转录因子的异常改变是恶性肿瘤最常见驱动因素之一[10],其中mRNA的加工在调控基因表达中具有重要作用[11]。NMD是真核细胞中监控RNA的重要机制，可通过识别并降解提前终止密码子，进而减少因截短型蛋白累积对细胞产生的毒性作用[12]。有研究认为，抑制NMD可能会使肿瘤中某些基因表达上调，而上调的基因或许在肿瘤发生发展中发挥抑癌基因作用[13]。报道显示，某些基因突变导致的翻译提前终止可引发NMD,NMD途径降解了提前终止翻译密码子的mRNA,产生的有害蛋白质可参与乳腺癌的发生[14]。

UPF1具有RNA依赖性解旋酶和ATP酶活性的蛋白分子，是目前研究较为清楚的NMD途径依赖因子，同时还参与了多种RNA结合蛋白介导的功能多样mRNA衰变途径[15,16]。研究发现，UPF1在不同恶性肿瘤中可分别发挥抑癌作用和促癌作用[17,18]。本研究分别采用IHC法和LSCM法检测乳腺癌组织及乳腺癌细胞中UPF1表达发现，UPF1在乳腺癌组织及乳腺癌AU565细胞中表达均显著上调，符合以往研究结果[19],提示乳腺癌中NMD过程可能被激活。由此本研究考虑沉默UPF1是否可对乳腺癌发生发展起到抑癌作用。采用siRNA技术构建UPF1低表达的重组AU565细胞，结果发现，转染siRNA-UPF1后AU565细胞中UPF1蛋白及mRNA表达水平均显著降低，提示UPF1低表达模型构建成功。观察沉默UPF1对AU565细胞侵袭和迁移能力影响发现，转染siRNA-UPF1后AU565细胞穿膜率和细胞迁移率均显著增加，UPF1表达的下调并没有起到预想的抑癌作用，那么上调UPF1表达发挥抑癌还是促癌作用，还待后续实验进一步探讨。EMT是肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤[20],其中E-candherin为抑EMT的分子标志物，Vimentin和N-cadherin为促EMT的分子标志物。本研究结果显示，转染siRNA-UPF1后AU565细胞E-candherin蛋白表达水平显著降低，Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平显著升高，提示沉默UPF1可诱导EMT发生，表明UPF1可能通过调控EMT参与乳腺癌的侵袭和转移，与以往研究报道基本一致[21]。蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Protein kinase B/ mammalian target of rapamycin, Akt/mTOR)通路是肿瘤发生发展中传统途径之一。研究显示，Akt/mTOR通路的异常激活，促进了乳腺癌细胞的侵袭与迁移，并诱导EMT的发生，参与肿瘤发生发展[22]。本研究结果显示，转染siRNA-UPF1后AU565细胞p-Akt和p-mTOR水平显著升高，提示下调UPF1后，促进了Akt和mTOR磷酸化，激活Akt/mTOR通路，进而参与乳腺癌细胞侵袭、迁移以及EMT过程，抑制NMD途径，符合以往研究结果[23,24]。

4、结论

UPF1在乳腺癌中表达上调，但沉默UPF1可能通过激活Akt/mTOR通路传导，促进乳腺癌细胞AU565的侵袭和迁移，并诱导EMT发生。后续还将探讨上调UPF1表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响，以进一步探讨UPF1在乳腺癌发生发展中的作用，为临床治疗提供更多可靠依据。

参考文献:

[4]阿布利克木·依明,艾力根·阿不都热依木,唐亮,等.miR-98靶向EZH2调控下咽癌细胞转移及其上皮-间充质转化的作用机制研究[J].西部医学,2022,34(4):475-481.

[6]杨畅,刘强.美国国家综合癌症网络临床实践指南:乳腺癌(2020V4)更新解读[J].临床外科杂志,2021,29(1),16-19.

[7]侯超,关馨,黎红霞,等.超声影像组学在乳腺癌治疗中的研究进展[J].西南医科大学,2023,46(4):352-356.

[9]JNCC编辑部.国家癌症中心权威发布中国最新癌症流行数据[J].抗癌之窗,2021(1):1.

[14]李延辉,方茅,谢敏如,等.siRNA介导的eIF3b基因沉默抑制乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和迁移[J].现代肿瘤医学,2021,29(2),201-205.

[19]胡凯,胡静,孙子久,等.UPF1在乳腺癌细胞中的表达与作用的研究[J].中国生物工程杂志,2022,42(1):58-71.

[22]李红娜,欧叶涛.PI3K/AKt/mTOR信号通路在乳腺癌中的研究进展[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2020,20(94):126-128.

[24]林海,林芮峰,邹自灏,等.UPF1通过mTOR/AKT信号通路调控膀胱癌的发生机制[J].广州医科大学学报,2021,49(4):19-26.

基金资助:国家自然科学基金委员会资助项目(81473268);

文章来源:张金标,苏轲,徐睿等.UPF1影响AU565乳腺癌细胞侵袭､迁移及EMT的机制[J].西部医学,2024,36(01):29-35.