根据世界卫生组织在2020年公布的全球癌症负担数据，乳腺癌(breast cancer, BC)已超过肺癌，成为世界上发病率第一的恶性肿瘤[1]。目前BC的主要治疗方法包括手术、化疗、放疗、免疫治疗和内分泌治疗 。但仍面临早期诊断手段有限或者肿瘤治疗后耐药、复发、转移。纳米医学的发展为癌症的治疗带来了新的视 角[2]。在众多的纳米粒子中，石墨烯基纳米材 料(graphene-based nanomaterials, GBNs)以其独特性质和化学结构脱颖而出。本文将对 GNBs在BC诊疗中的应用作一综述。

1、GBNs在癌症治疗中的特性

作为二维纳米材料，GBNs具有超薄结构、大比表面积、良好的导电性、优异的光学性能和力学性能且易于改构、生物相容性强等显著优点[3]。在既往研究中表明，GBNs在常规浓度下对正常细胞毒性较低，且经过修饰的GBNs主动靶向性增强，在肿瘤部位更多地蓄积，并可以随着时间的推移从体内清除，具有良好的生物安全性[4]。

用于BC治疗的GNBs衍生物主要包括氧化石墨烯(graphene oxide, GO)、还原氧化石墨烯(reduced graphene oxide, rGO)和石墨烯量子点(graphene quantum dots, GQDs)[5,6]。其三者的各自特性及在BC中的应用详见表1。

表1 GO、rGO、GQDs的特性及在乳腺癌诊疗中的应用

2、GNBs在乳腺癌化学治疗中的应用

化学治疗是BC治疗中的重要环节，以蒽环类和紫衫类做为基石，其代表药物为多柔比星(doxorubicin, DOX)及紫杉醇(paclitaxel, PTX)。几十年来，为减少化疗药物毒副作用，克服多药耐药(multidrug resistance, MDR)一直是研究的热点。GBNs作为药物载体可以减毒增效、逆转耐药。

铂类药物是在三阴性BC及HER2阳性BC治疗中常用的药物。然而铂类药物的副作用限制了它在临床中的应用，比如进入肿瘤细胞前的高度降解、非靶器官毒性和耐药性的发展等。为解决这些问题，GIUSTO等[7]制备了8臂聚乙二醇(polyethylene-glycol, PEG)功能化的GO纳米平台，以提高铂类药物的有效性和负载能力。结果表明，与无铂复合物相比，GO-PEG载体可以使用更低剂量的铂类药物，同时达到类似的效果，在MDA-MB-231细胞中可以有效抑制癌细胞的迁移。

SAWANT等[13]通过湿法共沉淀合成了rGO-氧化锌纳米颗粒，负载5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)。该纳米复合体在MCF-7细胞中显示出了增强的胞吞作用，抗癌活性显著提高，并且具有良好的生物相容性和 pH 响应性药物递送能力。

MDR是BC临床化疗中的主要问题之一，MDR的 机制已经被揭晓[24]。MDR与药物外排转运体P-糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp)过表达密切相关。LI等[8]通过以双分子信标(MDR1和ETS1)修饰GO和DOX的载体，开发了一种新型的纳米载药系统，MDR1和ETS1与靶基因结合后通过多重基因沉默抑制P-gp的表达，从而抑制DOX外排，逆转MDR。体外和体内研究均表明，该策略可以明显增加DOX耐药的MCF-7细胞中DOX的积累，明显提高耐药BC化疗的疗效。

3、GNBs在光疗中的应用

光疗(phototherapy, PT)包括光热治疗(photothermal therapy, PTT)和光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)。PT是通过光源照射后，尤其是通过近红外光(near-infrared light, NIR)照射病灶区，产生热或活性氧(reactive oxygen species, ROS)来杀灭癌细胞的方法。具有无创、低毒、高效和可控的优点。然而，PTT在BC诊疗中的应用一直面临着局限性，如NIR照射穿透深度低、光热转换效率低等，这将导致肿瘤消融不完全，因此复发风险较高[25]。

VAYALAKKARA等[18]应用PEG功能化的金纳米星-GQDs复合物负载双-N-亚硝基(BNNS)化合物合成了一种治疗TNBC的纳米平台。通过金纳米星局域表面等离子体共振转移到GQDs, 增强的等离子体能量激活了负载在GQDs表面的BNNS化合物，导致有效的一氧化氮(nitric oxide, NO)产生和PTT。实验结果显示该平台在1064nmNIR-II激光照射下，PTT和NO联合在4T1细胞及荷瘤小鼠中均展示出显著的抗癌效果。

rGO所显示的高NIR吸收能力使其在PT领域具有巨大的应用潜力。为了提高rGO的胶体稳定性，对其进行了PEG功能化处理。然而有研究报道了PEG涂层的免疫原性，即在PEG功能化的rGO静脉给药时发现了抗PEG抗体，这些抗体在随后的给药中介导了纳米材料的快速清除(称为加速血液清除现象)[26]。因此，研究新型涂层对rGO纳米材料的功能化至关重要。

LIMA-SOUSA等[14]以多巴胺(dopamine, DOPA)为还原剂优化了rGO的生产。实验结果表明，当GO与DOPA重量比为1∶5,反应时间为4小时，rGO对NIR吸收效率最高，且可以同时保持其纳米尺寸分布。随后，DOPA-rGO被巯基端聚2-乙基-2-恶唑啉功能化，显示出良好的物理化学特征、胶体稳定性和生物相容性。当808nmNIR照射5 min时，浓度为75 μg/mL(DOPA-rGO当量)的纳米复合物可引起温度升高36 ℃。该平台介导的PTT能消融MCF-7单层细胞，使其存活率<3%,可使异型MCF-7细胞球体存活率降至30%。

PDT是一种新兴的非侵入性、临床认可的局部治疗方法，通过激活光敏剂产生ROS杀伤癌细胞。PDT超越了现有的传统癌症治疗方式，因其精准定位、副作用小、低毒、可重复或配合其他治疗等优点，得到了研究者们极大关注，并且已经进入了临床应用[27,28]。

关于PDT的研究中，光敏剂是其中的核心部分，用作光敏剂的材料类型又分为有机和无机材料。二氧化钛(Titanium dioxide, TiO2)是一种常用的无机光敏剂，尽管具有优异的性能，但潜在的细胞毒性仍然是其在PDT中应用的障碍。此外，短波紫外光辐照下，原 始TiO2可以被激活，生成ROS,进一步限制了其应用[29]。为解决这些问题， RAMACHANDRAN等[19]利用氮杂化的GQDs(N-GQDs)对TiO2进行功能化， N-GQDs良好的生物相容性有助于降低TiO2在无光照射下的细胞毒性，这是设计PDT光敏剂的关键。在NIR照射下，ROS水平明显增加，诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

4、GNBs在HER2阳性乳腺癌靶向治疗中的应用

针对HER2阳性BC,化疗联合曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的治疗方案，可以显著提高肿瘤完全缓解率。单纯的靶向治疗抗肿瘤效率低，常常需联合化疗提高疗效。T-DM1、DS-8201等抗体偶联药物已经问市，并在BC治疗中取得了显著成效。GBNs可以为单抗类药物提供一个平台，使其与两种或多种不同机制的化疗药物结合，提高抗肿瘤疗效[20,30]。

KO等[20]设计了以PEG、二硫化物修饰的GQDs纳米复合物DL-CNPs, 同时负载赫赛汀和DOX。GQDs表面的赫赛汀能增强癌细胞对DL-CNPs的摄取。在肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中，DL-CNPs可以对高水平的谷胱甘肽和低pH环境双重响应，释放赫赛汀及DOX。体内及体外实验均表明，DL-CNPs对SK-BR-3细胞及荷瘤小鼠均有明显的抗癌作用。

CHEN等[9]合成了具有表面增强拉曼散射光谱(surface-enhanced Raman scattering spectroscopy, SERS)跟踪和双靶向功能的GO 基纳米载体。将铜银纳米颗粒和 Fe3O4 纳米颗粒附着在 GO 上，使其具有出色的 SERS 活性和磁靶向能力，再与抗HER2抗体缀合组成纳米复合物。将9氨基吖啶(9-aminoacridine, 9AA)和DOX做为载体药物。在SK-BR-3细胞中，通过SERS和荧光联合光谱跟踪动态细胞摄取，证明了该纳米复合物通过受体介导的内吞作用和外部磁场将药物高效地递送到癌细胞中。此外，这项研究还发现DOX和9AA在GO表面的吸附方式对它们抗癌能力起着关键作用，为开发GO基靶向多药递送纳米平台提供了 一个新的视角。

5、GBNs作为生物传感器在乳腺癌早期诊断及肿瘤显像中的研究进展

当前BC的早期诊断主要方法包括影像学和基于高通量测序或数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的液体活检[31]。BC的影像评估手段包括超声、钼靶、MRI、PET-CT、PET-MRI等，均不够灵敏或特异性不足，无法早期准确检测到微小病灶，更无法实现实时肿瘤显像，不能满足临床肿瘤早期诊断需求。随着纳米技术的不断发展，GBNs生物传感器引起了广泛关注，其具有灵敏度及特异性高、分析速度快、免酶标、低成本、生物相容性好、能够微型化和诊疗一体化等优点，为实现BC早期检测带来了希望。

ZOUARI等[15]报道了用rGO和金纳米粒子制成的生物传感器，采用飞秒直接伏安法，成功测定了患者血清样本中循环肿瘤微小RNAs(microRNAs, miRNAs),每次只需要5μL血清。该传感器免酶标、不依赖外界环境，可以直接提供循环肿瘤miRNAs的定量读数，而无需事先分离细胞、提取核酸、逆转录、扩增等，操作简便。实验结果表明该传感器有望实现高灵敏度、高效率地检测BC相关的循环肿瘤miRNAs。

HER2胞外区(extracellular domain of HER2,HER2-ECD)作为HER2阳性BC的肿瘤标志物，其状态的评估是HE2阳性BC早期诊断和病情监测的重要因素。SADEGHI等[16]应用rGO及铑纳米粒子研制了一种针对HER2-ECD检测的电化学传感器。这种传感器可以放大电化学信号，对HER2-ECD检测的动态范围为10.0～500 ng/mL,定性检测下限为0.667 ng/mL(显著低于临床界值),定量检测下限为2.01 ng/mL。因此，该传感器具有检测动态范围广、高灵敏度及特异性、稳定性好、可重复、成本低等优点，为实现HER2-ECD的无创检测和监测提供了平台。

在肿瘤显像的研究中，GO和rGO本身的荧光特性均不及GQDs, 即使通过修饰GO和rGO与磁性纳米颗粒或荧光探针结合，依然面临着莹光不稳定、闪烁和对环境的敏感性高的问题，对肿瘤诊断效率大打折扣。但GQDs靶向性欠佳，将导致非靶细胞标记，且已报道的GQDs自上而下的生产工艺通常需要苛刻的反应条件和复杂的合成过程，导致产量低，因此限制了其在肿瘤成像领域的应用。

FAN等[21]通过简单的水热法及酰胺化反应制备了具有细胞核及线粒体靶向成像特性的GQDs。对于细胞核成像，以廉价低毒的芘和聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)为前体制备了GQDs-PEI复合物。对于线粒体成像，通过三羧基苯基溴化膦 (tricarboxyphenyl phosphine bromide, TPP)的羧基与 GQDs-PEI胺之间，通过酰胺化反应制备了GQDs-TPP复合物。所制备的GQDs-PEI和GQDs-TPP收率可达60%以上，具有优异的光学性能和低细胞毒性，且可以分别选择性地靶向细胞核和线粒体成像。所制备的GQDs复合物可以有效克服传统荧光染料的细胞毒性和光漂白等缺点，可作为传统荧光染料的替代品。

众所周知，钆基螯合物是最常用的MRI造影剂，但在体内释放有毒金属离子。而GQDs作为一种有效的、无金属的MRI造影剂，可以解决这一问题，并具有更高的分辨率。WANG等[22]报道了一种与单层硼结合的GQDs作为新型MRI造影剂，其对比度优于临床造影剂钆二乙烯五乙酸，尤其针对血管的增强效果格外显著。并且该造影剂能通过血脑屏障，对脑转移瘤的诊断有重要意义。经过血液学和组织病理学分析表明，该造影剂在野生型小鼠中表现出无毒特性，因此可以作为目前临床常用的MRI钆基螯合物造影剂的安全替代品。

6、GBNs在乳腺癌联合治疗中的应用

化疗、放疗、靶向治疗及内分泌治疗是BC常用的治疗手段。然而，由于肿瘤的异质性及TME的形成，单一的治疗方法往往失败，因此迫切需要开发肿瘤联合治疗的新手段。GBNs的出现可以有效实现多种治疗方式的协同[32](图1)。例如：PTT联和PDT[10]、磁热疗法(magnetothermal therapy, MTT)联合磁动力疗法[11]、化学光热基因联合疗法[17]、光基因疗法[12]、光声动力联合治疗(photo-sonodynamic combination therapy, PSDT)[23]等两种或两种以上治疗BC的平台已被研发。

MAHESHWARI等[17]应用壳寡糖还原GO获得rGO,再用叶酸对其进行功能化用于TNBC的化学光热联合基因治疗。该平台可以有效地负载小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和DOX,并成功地在TNBC细胞内共定位。在808 nm NIR照射下，该平台以温度和pH响应的方式释放DOX。该纳米平台显示出高效负载siRNA和DOX的能力，在MDA-MB-231细胞中可以有效沉默靶基因和抑制癌细胞增殖。

WU等[12]利用多聚左旋赖氨酸修饰的GO与柠康共轭，并与胺型树枝状聚合物层叠组装，开发了一种pH敏感、电荷可转换的纳米复合物，用于光基因联合治疗。该纳米复合物具有较高的负载率，可以有效保护miRNA-21抑制剂(inhibitor of miRNA-21,miRNA-21i)免于酶解，并可进行有效转染。进入细胞后，pH诱导的电荷转换促进了miRNA-21i从内涵体或溶酶体分离释放到细胞质中，MDA-MB-231细胞经过处理后，miRNA-21的表达被明显沉默，靶蛋白PTEN和Bax上调。在808nmNIR照射下，纳米复合物展示出了增强的PT作用。因此，研究成果展示了GNBs在光基因联合治疗中的应用潜力。

图1 石墨烯基纳米平台联合治疗示意图。  

声动力治疗(sonodynamic therapy, SDT)作为一种由PDT衍生而来的新型无创治疗模式，借助低强度超声和声敏剂的结合，产生声毒性和ROS杀伤癌细胞，克服了光敏剂活化和NIR的浅穿透深度问题[33]。然而，现阶段SDT单一疗法的治疗效果仍然不能满足治疗需求，声敏剂应用的生物安全性以及MDR的产生，也促使SDT联合化疗、PDT等其他疗法协同发挥抗肿瘤作用。在PSDT中，通常使用可以同时被超声和光激活的一体化敏化剂。NENE等[23]以阳离子吗啉代酞菁作为一体化敏化剂，分别与氮掺杂的GQDs(N-GQDs)和氮硫掺杂的GQDs(NS-GQDs)共轭组成纳米复合物。研究结果显示，与 NS-GQDs 相比，N-GQDs表现出更高的 ROS 生成效率。在MCF-7细胞中，与单独治疗组相比，PSDT组癌细胞存活率最低，抗癌效果更显著。此外，没有观察到敏化剂相关的细胞毒性，所合成的一体化敏化剂生物安全性良好。

7、总结与展望

GBNs由于其独特的结构和理化性质，在BC的诊疗中具有广阔的应用前景。我们总结了GBNs在BC诊疗中的应用，包括化疗、PT、靶向治疗、早期诊断和肿瘤显像以及作为联合治疗的平台，以及改进GBNs功能的修饰策略。

笔者认为GBNs在BC诊疗中可以在以下几个方面进一步探索：①利用GBNs设计开发BC诊疗一体化平台进行早诊早治，解决不同疗法间的时间和空间差异性问题；②化学光疗联合基因治疗、免疫治疗是克服TME限制并解决MDR的有效途径。然而，目前还没有相关的研究来探讨化疗药物与基因药物及免疫药物的适宜比例，这些药物之间是否会出现相互干扰也是未知的，需要进一步研究；③关于保乳术中切缘显像、新辅助化疗后的MRI评估肿瘤变化以及前哨淋巴结成像活检，均要求对小病灶的识别具有较高的准确性。这些关键节点对BC患者后续治疗的选择至关重要，因此仍需进一步探索研究GBNs在肿瘤成像领域中的应用。

总之，本篇综述介绍了利用GBNs的独特理化性能构建平台应用于BC诊疗的研究进展。同时，作者阐明了亟待解决的问题和挑战，以期推动GBNs综合诊疗平台走向BC的临床应用。

基金资助:2022年度广东省基础与应用基础研究基金联合基金项目(编号:2022A1515110270);海南省“南海新星”医疗卫生人才平台项目资助(编号:28号);

文章来源:张博诚,王胜涛.石墨烯基纳米材料在乳腺癌诊疗中的应用研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(07):1370-1374.