乳腺癌是困扰女性健康的恶性肿瘤。虽然临床上治疗管腔（luminal)A型乳腺癌的疗效较好[1]，但luminal A型乳腺癌发生、侵袭、扩散的病理机制尚不清楚。研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）分泌的外泌体能促进MCF-7乳腺癌细胞生长[2]。肿瘤微环境含有的MSC及其分化的肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAF）通过旁分泌机制调节癌症干细胞（CSC）生长[3]。MSC具有促进肿瘤发生和转移的能力[4]。研究还发现，肿瘤相关巨噬细胞表达白细胞介素（interleukin,IL)-8[即趋化因子（C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)-8]增强了乳腺癌和卵巢癌的转移能力[5,6]。口腔鳞状细胞癌表达的IL-8通过趋化因子受体（C-X-C motif chemokine receptors,CXCR)2-转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β）通路募集骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）迁移到肿瘤微环境，促进了癌细胞的生长和转移能力[7]。由此可见，IL-8和MSC在构成肿瘤微环境、调控肿瘤生长或转移中均发挥关键作用。本实验以MCF-7乳腺癌细胞条件培养基刺激BMSC，观察CXCR1/2-蛋白激酶B(Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）信号轴对BMSC增殖、凋亡及迁移的影响及其分子机制，为抑制luminal A型乳腺癌发生发展提供参考。

1、材料与方法

1.1主要材料

BMSC和MCF-7细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。RPMI-1640和DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。兔抗人Akt和磷酸化Akt(p-Akt）抗体、兔抗人m TOR和磷酸化m TOR(p-m TOR）抗体、兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔Ig G二抗均购自英国Abcam公司。Reparixin(CXCR1/2抑制剂）购自美国Med Chem Express公司，GSK690693(Akt抑制剂）购自美国Selleck公司。IL-8酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡试剂盒、MTT、BCA蛋白检测试剂盒和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）均购自上海碧云天生物技术有限公司。IX53倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，FACSAriaⅡ流式细胞仪购自美国BD公司，Tanon 6200型发光成像仪购自上海天能公司，Spectra Max i D3酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

BMSC用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。MCF-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。两种细胞均采用3代对数生长期状态良好的细胞进行实验。

1.2.2 MCF-7细胞条件培养基制备

将MCF-7细胞在5%CO2、37℃培养12 h后，吸出培养上清液，1 000 r/min离心3 min后，弃掉沉淀提取上清液。按照体积比4∶1将无胎牛血清的RPMI-1640培养基和MCF-7细胞培养上清液混匀，则为MCF-7细胞条件培养基。

1.2.3 BMSC分组

正常环境下培养的BMSC为对照组。以MCF-7细胞条件培养基培养的BMSC为MCF-7条件培养基组。向MCF-7条件培养基组添加10 nmol/L GSK690693为Akt抑制剂组，向MCF-7条件培养基组添加10µmol/L Reparixin为CXCR1/2抑制剂组。

1.2.4 MTT实验检测各组BMSC增殖情况

将BMSC以4×103个/孔接种至96孔细胞培养板，孵育48 h后每孔加入20µL MTT溶液，孵育4 h后弃掉上清液，每孔加150µL二甲基亚砜，摇动样品，于酶标仪490 nm波长处检测各组BMSC光密度（OD）值。OD值代表细胞增殖水平，实验重复3次。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI双标记细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率

各组取1×105个细胞，1 000 r/min离心3 min，弃上清液后，用195µL Annexin V-FITC结合液重悬各组BMSC，加入5µL Annexin V-FITC和10µL碘化丙啶（PI），避光室温孵育25 min，流式细胞仪检测各组BMSC凋亡率（早期凋亡率Q4+晚期凋亡率Q2），实验重复3次。

1.2.6 Transwell细胞迁移实验检测各组BMSC的迁移能力

将200µL BMSC悬液以1×105个/室接种至Transwell细胞小室。根据BMSC实验分组，Transwell细胞小室下方腔室加入相应试剂或培养基。孵育14 h后，4%多聚甲醛溶液室温固定1 h,1.0%结晶紫染色40 min[8]。置于200倍倒置显微镜下拍照，Image J 1.8.0图像软件计算各组BMSC迁移数目，实验重复3次。

1.2.7 ELISA检测两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中IL-8蛋白含量

正常培养BMSC和MCF-7细胞12 h后，分别提取两种细胞的培养上清液，并制备MCF-7细胞条件培养基，方法同1.2.2。按照IL-8 ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪450 nm波长处检测3种液体的OD值，计算IL-8蛋白含量，实验重复3次。

1.2.8 Western blot检测各组BMSC的Akt/p-Akt和m TOR/pm TOR蛋白表达

将各组BMSC接种到25 cm2透气斜口培养瓶中（2×106个/瓶），37℃、5%CO2孵育48 h后，RIPA裂解液裂解各组BMSC,BCA蛋白浓度试剂盒检测各组BMSC蛋白浓度。80 V电泳30 min;120 V电泳45 min。75 V 180 min转膜到PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜90 min。分别添加兔抗人p-Akt抗体（1∶600）、Akt抗体（1∶550）、p-m TOR抗体（1∶500）、m TOR抗体（1∶450）和β-actin抗体（1∶1 000),4℃孵育过夜。HRP标记山羊抗兔Ig G(1∶800）室温孵育4 h。发光成像仪显影曝光，Image J 1.8.0图像分析软件计算各蛋白条带灰度值，实验重复3次。

1.3统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行Tukey-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组BMSC增殖情况比较

与对照组比较，MCF-7条件培养基组BMSC的增殖水平升高（P<0.05）；与MCF-7条件培养基组比较，CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC的增殖水平均降低（P<0.05），见表1。  

表1 各组BMSC实验结果的比较  

2.2 各组BMSC凋亡率比较

与对照组比较，MCF-7条件培养基组BMSC凋亡率降低（P<0.05）；与MCF-7条件培养基组比较，CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC凋亡率均增高（P<0.05），见表1、图1。

图1 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率   

2.3 各组BMSC迁移能力比较

与对照组比较，MCF-7条件培养基组BMSC迁移数目增加（P<0.05）；与MCF-7条件培养基组比较，CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC迁移数目均减少（P<0.05），见表1、图2。

图2 各组BMSC细胞迁移的典型图像（结晶紫染色，标尺=50µm)   

2.4 两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中IL-8蛋白含量比较

MCF-7细胞条件培养基和MCF-7培养上清液中IL-8蛋白含量均高于BMSC培养上清液（P<0.05），见图3。

图3 两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中IL-8蛋白含量比较

2.5 各组Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达比较

与对照组比较，MCF-7条件培养基组p-Akt和p-m TOR蛋白相对表达量均增高（P<0.05）；与MCF-7条件培养基组比较，CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组p-Akt和p-m TOR蛋白相对表达量均降低（P<0.05），见图4、表2。

图4 Western blot检测各组BMSC的Akt/p-Akt和m TOR/p-m TOR蛋白表达     

表2 各组BMSC的Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白相对表达量比较  

3、讨论

趋化因子参与构成乳腺癌微环境，影响肿瘤微环境MSC、血管内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞的生物特性[9]。IL-8可调节血管生成、肿瘤干细胞存活以及免疫抑制等促肿瘤功能[10]。IL-8还可招募MSC迁移至肿瘤组织，进入肿瘤微环境的MSC分化为CAF，进而促进肿瘤发展及转移[9]。因此，趋化因子可能是介导MSC、CAF及肿瘤进展的关键调控因子，干扰MSC迁移至肿瘤组织可抑制乳腺癌发生发展。Morein等[11]认为，乳腺癌细胞高表达IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等趋化因子，能够促进乳腺肿瘤细胞及肿瘤干细胞增殖和存活，控制肿瘤细胞衰老，并诱导上皮-间质转化和基质金属蛋白酶的表达；促进对化疗和内分泌治疗的抵抗，并介导肿瘤-基质相互作用。Zhang等[12]发现，乳腺癌细胞诱导巨噬细胞表达高水平的IL-15和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF），通过抑制CD8+T细胞的募集来调节肿瘤微环境，进而促进乳腺癌细胞生长及耐药。Wu等[13]发现，乳腺癌干细胞分泌IL-8，增强了雌激素受体的活性，促进肿瘤细胞抵抗雌激素和细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6）抑制剂的治疗而产生耐药性，同时促进肿瘤细胞转移。本研究结果亦显示，MCF-7细胞培养上清液中含有IL-8蛋白；与对照组比较，MCF-7条件培养基组BMSC的增殖水平增高，细胞凋亡率降低；CXCR1/2抑制剂组或Akt抑制剂组上述指标均较MCF-7条件培养基组呈相反变化。提示MCF-7细胞条件培养基含有的IL-8可激活Akt信号通路，促进BMSC增殖，抑制其凋亡，阻断CXCR1/2或抑制IL-8表达可成为预防luminal A型乳腺癌进展的潜在治疗策略。考虑其原因可能是MCF-7细胞条件培养基中高表达的IL-8等促癌趋化因子可缩短BMSC细胞周期，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[11]。

迁移和侵袭是恶性肿瘤发展的关键环节，肿瘤-基质-炎症网络构成luminal A型乳腺癌转移的关键因素[14]。趋化因子可促进肿瘤细胞和内皮细胞迁移及血管生成，并募集MSC迁移到肿瘤组织而成为热点分子[11,15]。Park等[16]发现，乳腺癌细胞表达的IL-8通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）通路促进间充质标志物的表达、肿瘤发生和肺转移。本研究结果亦显示，MCF-7条件培养基组BMSC迁移数目较对照组增加，而CXCR1/2抑制剂组或Akt抑制剂组BMSC迁移数目较MCF-7条件培养基组减少，提示MCF-7条件培养基可激活BMSC的Akt-m TOR信号通路，促进BMSC迁移，进而归巢到乳腺癌微环境。考虑其原因可能为MCF-7细胞高表达的IL-8结合于BMSC细胞膜表面CXCR1/2，进而激活BMSC的Akt-m TOR信号通路，从而促进细胞微丝或微管收缩形成伪足，引起细胞定向迁移[17]。也有研究发现，人卵巢癌细胞分泌的IL-6和IL-8通过转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、Akt等信号通路促进肿瘤细胞生长、迁移和侵袭[18]。罗后宙等[19]认为，人前列腺癌组织高表达IL-8、淋巴细胞抗原6G(lymphocyte antigen 6G,Ly-6G）和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,H3CIT），可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase,PI3K）/Akt信号通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Deng等[20]研究发现，三阴性乳腺癌细胞过表达IL-8，通过PI3K/Akt和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路促进肿瘤细胞的迁移和生长。本研究结果亦显示，MCF-7条件培养基组BMSC的p-Akt和p-m TOR蛋白表达量均较对照组升高，而CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组上述指标均较MCF-7条件培养基组呈相反变化，提示MCF-7细胞条件培养基中的IL-8结合于BMSC细胞膜表面CXCR1/2，可激活BMSC的Akt及其下游的m TOR信号通路。

综上所述，MCF-7细胞条件培养基中的IL-8结合于BMSC细胞膜表面CXCR1/2，可激活Akt-m TOR信号通路，促进BMSC的增殖和归巢到肿瘤微环境，进而促进luminal A型乳腺癌细胞的生长和转移。

参考文献:

[8]刘娜,张晓东,李永涛,等.高糖环境下P物质活化Akt通路促进间充质干细胞增殖和成血管内皮细胞分化的研究[J].天津医药,2022,50(5):461-465.

[19]罗后宙,陈国强.中性粒细胞胞外诱捕网通过上调DU145人前列腺癌细胞IL-8表达促进前列腺癌细胞增殖､侵袭及迁移[J].细胞与分子免疫学杂志,2023,39(3):261-267.

基金资助:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(2020-KYYWF-0010);

文章来源:刘丹阳,李永涛,张海燕,等.乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响[J].天津医药,2024,52(05):454-458.