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1-磷酸鞘氨醇信号激活对乳腺癌BT549细胞增殖的影响

2024-06-06 48 上传者：管理员

摘要：目的研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)信号激活对乳腺癌BT549细胞增殖的影响。方法将细胞分为对照组和实验组。实验组用0.1、1.0和10.0μmol·L-1 S1P受体激动药SEW2871处理乳腺癌细胞72 h;对照组用含0.1%胎牛血清培养基培养。用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况。建立乳腺癌BT549细胞过表达S1P受体的细胞模型，将转染的细胞分为空白质粒组(LUC)、野生型S1P受体组(WT)、S1P受体磷酸化位点突变组(MUT)。用MTT法检测细胞增殖情况，并计算细胞增殖率；用克隆集落形成实验检测细胞克隆形成能力。用S1P受体拮抗药W146(10μmol·L-1)及蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制药MK2206(90 nmol·L-1)检测S1P信号在乳腺癌BT549细胞增殖中的作用，用蛋白质印迹法检测磷酸化信号传导与转录激活因子-3(p-STAT3)蛋白、原癌基因c-Myc蛋白的表达情况。结果对照组和0.1、1.0和10.0μmol·L-1实验组的细胞增殖率分别为1.00±0.03、1.13±0.06、1.06±0.10和1.07±0.03,SEW2871在0.1μmol·L-1时可促进细胞增殖(P<0.05)。过表达S1P受体后，WT组、MUT组与LUC组相比，细胞增殖率和克隆集落形成数量均明显增加(均P<0.05)。用W146处理后，LUC组、MUT组、WT组的细胞相对增殖率分别为1.25±0.12、1.31±0.03和1.43±0.14;用MK2206处理后LUC组、MUT组、WT组的细胞相对增殖率分别为0.87±0.15、0.77±0.03和0.88±0.02;WT组、MUT组与相应DSMO组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。用W146处理后，LUC组、MUT组、WT组的细胞克隆形成数量分别为(65.65±5.12),(141.48±5.63)和(93.64±5.14)个，WT组、MUT组与相应DSMO组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。MK2206处理后，LUC组、MUT组、WT组的p-STAT3蛋白相对表达水平分别为0.67±0.04、0.69±0.08和0.81±0.06,原癌基因c-Myc蛋白相对表达水平分别为1.69±0.03、0.70±0.10和0.67±0.07,WT组、MUT组的上述指标与DMSO组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 S1P信号激活可促进乳腺癌BT549细胞增殖，其机制可能与AKT及STAT3信号通路有关。

关键词：
1-磷酸鞘氨醇信号
1-磷酸鞘氨醇受体激动药和拮抗药
乳腺癌细胞
增殖
蛋白激酶B信号通路抑制药
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1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)是细胞膜鞘脂代谢的产物。体内神经酰胺在神经酰胺酶的作用下生成鞘氨醇，在鞘氨醇激酶作用下生成S1P[1]。鞘氨醇激酶是鞘脂代谢过程中的关键酶，有2种同工酶。在乳腺癌细胞中鞘氨醇激酶表达增高，促进乳腺癌细胞的增殖[2]。S1P以自分泌或旁分泌的方式，与特异的S1P受体结合，激活多种信号通路，发挥不同的生物学效应。研究表明，S1P可调控肿瘤的发生发展过程，包括炎症驱动的肿瘤发生、新生血管生成、肿瘤细胞生长和侵袭等[3,4]。乳腺癌患者S1P信号途径常被异常激活且与患者预后情况相关[5]。本研究用细胞转染技术建立过表达S1P受体的乳腺癌细胞模型，旨在探索S1P信号在乳腺癌BT549细胞增殖中的作用。

一、材料与方法

1 材料

细胞人乳腺癌细胞BT549细胞，购自上海中科院细胞库，由本实验室培养保存。

药品SEW2871(S1P受体激动药),规格：每支10 mg, 批号：ab120983,美国Abcam公司生产；W146(S1P受体拮抗药),规格：每支1 mg, 批号：B7442,美国APExBIO公司生产；MK2206[蛋白激酶B(protein kinase, AKT)信号通路抑制药],规格：每支50 μg, 批号：A3010,美国APExBIO公司生产。S1P受体兔抗人多克隆抗体，美国Abcam公司生产；信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷酸化STAT3(phosphorylate STAT3,p-STAT3)、AKT、磷酸化AKT(phosphorylate AKT,p-AKT)、c-Myc抗体、HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白G,均为美国CST公司生产。

仪器Axio observer A1荧光显微镜，德国蔡司有限公司产品；Alpha Imager Is 2200凝胶成像系统，美国Alphaimager公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[6]6]

将人乳腺癌BT549细胞加入含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每2 d换液1次。选取生长状态好，处于对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 细胞分组与给药方法

乳腺癌BT549细胞分成对照组和实验组。对照组用含0.1%胎牛血清培养基培养，实验组用0.1、1.0、10.0 μmol·L-1S1P受体激动药SEW2871处理乳腺癌BT549细胞72 h。

过表达S1P受体的乳腺癌BT549细胞分3组：空白质粒组(LUC)、野生型S1P受体组(WT)、S1P受体磷酸化位点突变组(MUT),分别用DMSO、S1P受体拮抗药W146(10 μmol·L-1)、MK2206(90 nmol·L-1)处理S1P受体过表达的乳腺癌细胞。

2.3 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测S1P受体激动药对乳腺癌细胞增殖的影响[7]7]

取处于对数生长期BT549细胞，按照每孔细胞数800个，接种至96孔板，培养箱中培养24 h后，按照“2.2”分组和方法处理，培养72 h, 每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL,置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h, 弃液，各孔加入二甲基亚砜150 μL,振荡10 min, 用酶标仪检测各孔在波长570 nm的光密度(optical density, OD)值，计算细胞生长增殖率。

取对数生长期过表达S1P受体的LUC组、WT组、MUT组细胞，每孔800个细胞接种至96孔板，分别接种5块板，3组细胞分别加入DMSO、S1P受体拮抗药W146(10 μmol·L-1)和MK2206(90 nmol·L-1),每组设3个复孔，含10%胎牛血清培养8 d, 分别取0、2、4、6、8 d培养板，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL,置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h, 弃液，各孔加入二甲基亚砜150 μL,振荡10 min, 用酶标仪检测各孔在波长570 nm的OD值，计算乳腺癌细胞生长增殖率。

2.4 克隆集落形成实验检测过表达S1P受体及受体拮抗药W146对乳腺癌细胞克隆集落形成数量的影响[8]8]

各组分别取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，细胞计数，并用细胞培养基调成200 cell·mL-1,接种至6孔板中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀，置入培养箱中培养24 h, 分别加入DMSO及受体拮抗药W146(10 μmol·L-1)继续培养14 d, 甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数克隆集落形成数量。

2.5 蛋白质印迹法检测MK2206对S1P信号通路蛋白表达的影响[9,10]9-10]

收集细胞，按照细胞质蛋白提取试剂盒操作，提取细胞质蛋白，酶标仪定量，取蛋白30 μg上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳，转移至NC膜，5%的脱脂牛奶室温封闭2 h, 分别用STAT3、p-STAT3、c-Myc抗体(1∶500)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(1∶1 000),4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h, TBST洗膜10 min×3次，配制新鲜发光液，将膜孵育3 min, 暗室X光片曝光30 s～5 min, 显影30 s, 定影30 s成像，凝胶成像系统成像，凝胶分析软件进行灰度值分析，以目的蛋白与GAPDH条带积分光密度比值表示蛋白表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据用

表示，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 S1P信号的激活可促进乳腺癌BT549细胞的增殖

对照组为含0.1%胎牛血清培养基，实验组用0.1、1.0、10.0 μmol·L-1 SEW2871处理。

与对照组相比，0.1 μmol·L-1 SEW2871可促进乳腺癌BT549细胞增殖，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2 过表达S1P受体可促进乳腺癌BT549细胞增殖和细胞克隆集落形成，并可被拮抗药W146所拮抗

LUC组、WT组、MUT组分别用DMSO、10 μmol·L-1 W146和90 nmol·L-1MK2206处理S1P受体过表达的乳腺癌细胞。

与LUC组相比，WT组、MUT组的细胞增殖率和细胞克隆集落形成数量均明显升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。S1P受体拮抗药W146能减弱S1P信号激活所引起的促增殖和促细胞克隆集落形成作用(P<0.05,P<0.01),见表2。

3 MK2206可抑制S1P信号过度激活引起的乳腺癌BT549细胞增殖

与LUC相比，WT、MUT组细胞增殖比均明显升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。与DMSO组相比，AKT信号通路抑制药MK2206可减弱S1P信号过度激活引起的促进乳腺癌BT549细胞的增殖作用，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01),见表3。

表1 1-磷酸鞘氨醇(S1P)信号的激活可促进乳腺癌BT549细胞的增殖

表2 过表达S1P受体促进乳腺癌BT549细胞增殖和细胞克隆形成并可被拮抗药W146所拮抗

4 MK2206可抑制S1P信号激活引起STAT3信号相关蛋白表达

与LUC相比，WT、MUT组的c-Myc蛋白相对表达水平均显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);用MK2206处理后，p-STAT3和c-Myc蛋白相对表达水平均明显下调，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),提示S1P信号通路可能参与STAT3、c-Myc激活过程，见表4和图1。

表3 过表达S1P受体促进细胞增殖可被MK2206抑制

图1 MK2206可抑制S1P信号激活引起STAT3信号相关蛋白的表达情况

三、讨论

研究表明，乳腺癌中SphK1/S1P信号途径作用与患者不良的预后和总体生存密切相关[11]。S1P受体是G蛋白偶联受体，位于细胞膜、细胞质或细胞核，与S1P结合，可诱导肿瘤细胞迁移，调控肿瘤细胞增殖[12]。不同的乳腺癌细胞表达不同类型的S1P受体，从而介导不同的下游通路，引起肿瘤细胞功能的改变。

本课题组前期研究表明，S1P信号激活促进乳腺癌MCF-7细胞增殖，且增殖作用可被S1P受体拮抗药W146抑制[13],而对MDA-MB-231、T47D细胞无明显作用[14,15]。本研究中S1P受体激动药SEW2871可促进乳腺癌BT549细胞增殖，说明S1P信号通路激活参与乳腺癌BT549细胞增殖调节。本研究用细胞转染技术建立过表达野生型S1P受体和S1P受体磷酸化位点突变型的乳腺癌细胞模型，并用特异性受体拮抗药W146进行干预，阐述S1P信号在乳腺癌细胞增殖中的作用，结果表明，过表达S1P受体后可促进BT549细胞的增殖和克隆集落形成，此作用可被其受体拮抗药所抑制，进一步说明S1P信号通路激活是乳腺癌BT549细胞增殖主要调节因子。AKT信号通路与乳腺癌细胞增殖密切相关。本研究用AKT信号通路抑制药MK2206处理细胞，结果表明，过表达S1P受体引起的BT549细胞增殖及克隆集落形成作用均被MK2206抑制或取消，由此可知，S1P信号通路激活参与的乳腺癌BT549细胞增殖与AKT信号通路相关。

STAT3信号通路的激活与多种恶性肿瘤有关，与细胞增殖和克隆集落形成密切相关[16]。本研究结果表明，过表达S1P受体可升高与增殖密切相关分子p-STAT3、c-Myc蛋白的表达水平。当应用MK2206处理细胞，p-STAT3、c-Myc蛋白表达下降，表明S1P信号激活引起的细胞增殖与STAT3信号通路密切相关，而与AKT信号通路的关系并未得出结论，需进一步实验证实。

参考文献:

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基金资助:黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研基金资助项目(2019-KYYWF-1240); 齐齐哈尔市科技计划联合引导基金资助项目(LHYD-202019);

文章来源:宋娟,王明,刘欣洋,等.1-磷酸鞘氨醇信号激活对乳腺癌BT549细胞增殖的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1578-1582.