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靶向Nrf2-铁死亡通路与缺血性脑卒中后脑损伤治疗研究进展

2024-02-02 232 上传者：管理员

摘要：铁死亡在缺血性脑卒中后脑损伤的病理生理过程中起着至关重要的作用。通过激活核因子-红细胞系2相关因子2(Nrf2)在转录上控制铁死亡途径的许多关键成分进而抑制铁死亡，将其作为缺血性脑卒中后脑损伤的治疗靶点。本文简要描述了铁死亡过程及其在缺血性脑卒中后脑损伤中的作用。同时对Nrf2与铁死亡之间的关系进行重要的概述，重点综述药物靶向激活Nrf2通路抑制铁死亡对缺血性脑卒中后脑损伤的治疗作用。

关键词：
缺血性脑卒中
缺血性脑卒中后脑损伤
脑血管病
铁死亡
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缺血性脑卒中（ischemic stroke）是世界范围内死亡和长期残疾的主要原因之一。最新的流行病学表明，脑血管病已成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡原因，且发病有逐年增多的趋势[1]。目前我国现存脑血管病患者750余万人，其中约70%为缺血性脑卒中[2]。近年研究显示铁死亡（ferroptosis）参与脑卒中后神经损伤发病机制，同时抑制铁死亡可以阻断脑卒中后神经损伤[3]。核因子红细胞系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是细胞和机体防御内源性和外源性应激的主要调节因子，通过调控多种细胞保护基因进而抑制铁死亡[4]。因此激活Nrf2从而抑制铁死亡进而在缺血性脑卒中发挥神经保护作用。本文简要描述铁死亡过程及其在缺血性脑卒中后脑损伤中的作用。同时对Nrf2与铁死亡之间的关系进行重要的概述，重点综述药物靶向激活Nrf2通路抑制铁死亡对缺血性脑卒中后脑损伤的治疗作用。

1、铁死亡及其与其它死亡方式区别

1.1 铁死亡

铁死亡是在2012年提出的新概念，它是一种由铁依赖性脂质过氧化引起的程序性细胞死亡，不同于凋亡、坏死、自噬和其他形式的细胞死亡[5,6]。脂质过氧化物清除功能障碍、氧化还原活性铁的存在以及含有多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）的磷脂过氧化是铁死亡的三个基本特征。生物化学上，细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）的耗尽和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4）的活性失活导致细胞铁死亡，因为GPX4催化的还原反应不能消除过量产生的脂质过氧化物[7]。铁代谢和脂质过氧化信号被认为是铁死亡的核心调控因素。铁处理代谢失调、不稳定氧化还原活性铁的增加和脂质过氧化的增加被认为是铁死亡的可能致病机制，因此铁死亡与脂质过氧化、抗氧化系统和铁代谢障碍有关。铁死亡的最后一步是脂质过氧化或其次级产物（如4-HNE和MDA）直接或间接诱导血浆或细胞器膜上的孔隙形成，最终引发细胞死亡。

1.2 铁死亡与其它死亡方式的区别

目前认为细胞死亡方式包括不受控制的细胞坏死（uncontrolled necrosis,UN）和调节性细胞死亡（regulated cell death,RCD)[8]。RCD包括调节性细胞坏死（regulated necrosis,RN）和凋亡（apoptosis）。RN包括程序性坏死（necroptosis）、焦亡（pyroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、parthanatos以及新发现的铜死亡[8,9,10]。程序性坏死是一种由细胞外或细胞内稳态扰动触发的RCD模式，其依赖于MLKL、RIPK3和RIPK1的激酶活性[10]。焦亡是一种依赖于gasdermin蛋白家族成员形成质膜孔的RCD，通常是炎症半胱天冬酶激活的结果[10]。凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命，有一系列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的、非炎症性细胞死亡的过程[10]。常见细胞死亡方式之间区别见Tab.1。

2、Nrf2与铁死亡

Nrf2/抗氧化反应原件（antioxidant response elements,ARE）通路是机体中重要抗氧化反应通路[11,12]。在生理条件下，Nrf2主要定位于细胞质内，与Nrf2上游调控因子Keap1结合，经泛素蛋白酶途径降解，使Nrf2维持在基础水平[13]。当受到过多的氧化刺激时，Nrf2从Keap1中解放出来，转运到细胞核，与抗氧化和细胞保护蛋白ARE序列结合，启动ARE控制的抗氧化酶基因的转录。在铁死亡途径中级联或相互作用的大多数酶和蛋白质，如溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11）、GPX4、谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate-cysteine ligase,GCLC）、铁代谢基因转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TFR1）、铁蛋白的亚基（ferroportin,FPN）、血红素加氧酶1(HO-1）、铁蛋白（ferritin）由转录因子Nrf2的抗氧化反应元件调节。因此，Nrf2是脂质过氧化和铁死亡的关键调节因子，上调Nrf2能够抑制铁死亡，推断与脂质过氧化增加和铁死亡相关的疾病可能是Nrf2信号异常的结果[14,15,16](Fig.1）。

3、铁死亡介导缺血性脑卒中后神经元损伤

缺血性中风后，大脑出现铁代谢失调和铁积累[17]。脑缺血后脑组织中的酸性环境可以抑制铁与转铁蛋白的结合，导致铁与转铁蛋白的解离[18]。神经元很容易吸收这种未结合的铁，导致细胞内铁升高[19]。铁蛋白[20]、TFR1[21,22,23,24,25]和DMT1[22,24]在缺血性中风中也会增加。同时，缺血性卒中后铁外流减少也可能是铁累积的原因[26,27,28,29]。

在体外和体内缺血模型中，脂质过氧化物的水平均显著升高，而抗氧化防御体系GSH水平[25,30,31,32,33,34]、SLC7A11[22,24,25,35,36,37]和GPX4[21,22,23,24,25,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40]的水平显著降低。在缺血性中风中，补充GSH具有抑制缺血性中风引起的脑损伤的治疗作用[41]。GSH合成和铁死亡也受到细胞内谷氨酸的调节，缺血性中风后使细胞内谷氨酸摄入减少，导致细胞外释放增加[42]，从而抑制系统Xc-脑缺血期间快速的能量损失导致谷氨酸释放[43,44]。谷氨酸的过度释放可能导致GPX4对脂质过氧化物的修复能力丧失[45,46,47,48,49]。因此，缺血性卒中后细胞外谷氨酸的增加也可能引发铁死亡。

大脑中富含PUFA，使其在缺血条件下更容易受到脂质过氧化的影响。脑缺血期间ATP的快速丢失导致细胞膜上的离子泄漏失控，导致膜去极化和谷氨酸释放[45,46,47]。谷氨酸的过度释放导致磷脂酶的激活、磷脂水解、花生四烯酸释放[45,50,51]，以及GPX4对脂质过氧化物的修复能力的丧失[48,49]。缺血性卒中ACSL4上调[23,32,34,38,39,52]。ACSL4的过度表达加剧缺血性脑损伤，而沉默AC-SL4通过抑制铁死亡保护小鼠脑免受缺血诱导的损伤[52]。12/15-LOX直接氧化含有PUFA的脂质膜，是缺血性卒中后神经元损伤中铁死亡的关键调节因子。在缺血小鼠脑中观察到12/15-LOX的表达和活性升高，其与MDA共定位[39,53,54]。12/15-LOX的敲除保护小鼠神经元免受脑缺血损伤[53,55]。ALOX15敲除增加神经元对铁死亡的抵抗力[56]。胞浆磷脂酶A2α(c PLA2α）是一种Ca2+依赖性胞浆酶，控制PUFAs的花生四烯酸释放[57,58]。脑缺血诱导的Ca2+输入激活c PLA2α以增强脂质过氧化。脑缺血后，c PLA2α增加，其敲低可显著降低脂质过氧化和脑损伤[50,59,60,61]。

4、激活Nrf2抑制铁死亡治疗脑卒中

上调Nrf2能够抑制铁死亡。近年来通过激活Nrf2抑制缺血性脑损伤取得了一定进展。在雄性ICR小鼠MCAO模型中，右美托咪定（dexmedetomidine）能够改善神经行为评分、降低脑梗死体积、减少MDA和Fe2+含量以及TFR1蛋白表达，同时增加GSH含量及SLC7A11和GPX4蛋白表达，右美托咪定预处理可显著减轻脑组织线粒体损伤，而Nrf2抑制剂ML385逆转右美托咪定的神经保护作用，表明右美托咪定通过激活Nrf2进而抑制铁死亡在脑缺血中具有神经保护作用[25]。在大鼠大脑动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型中，依达拉奉在相关测试中对脑梗死以及神经和感觉运动功能表现出保护作用，降低MCAO/R大鼠脑组织中Fe2+、MDA和LPO的含量，并增加GSH的含量以抑制铁死亡，依达拉奉上调Nrf2、GPX4和FPN的表达，Nrf2的核定位增加，炎症相关指标IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO的水平降低，表明依达拉奉可能通过激活Nrf2/FPN途径抑制铁死亡以减轻脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)[33]。β-石竹烯（β-Caryophyllene,BCP）改善MCAO/R后的神经评分、梗死体积和病理特征，BCP明显增强Nrf2核转位，激活Nrf2/HO-1通路，从而保护其免受铁死亡的影响，体外研究显示了同样的结果，BCP降低OGD/R诱导的ROS的产生和铁的积累，而BCP的神经保护作用被Nrf2抑制剂ML385逆转。表明，BCP通过激活Nrf2进而抑制铁死亡，在脑缺血中发挥神经保护作用[38]。Vitexin是一种从各种可食用和药用植物中提取的具有生物活性的黄酮类化合物，具有神经保护等多种药理作用。在本研究中，我们建立了氧-葡萄糖剥夺和复氧（OGD/R）神经元细胞和大脑中MCAO/R大鼠模型。分别用CCK-8法和流式细胞仪检测细胞活力、细胞凋亡和活性氧（ROS）水平。苏木精-伊红染色、TTC、TEM、免疫荧光分析和蛋白质印迹法研究Vitexin的作用。结果表明，Vitexin可提高OGD/R细胞模型的细胞活力，减少细胞凋亡。Vitexin调节Keap1/Nrf2/HO-1相对蛋白水平的表达，在OGD/R诱导的脂质ROS的产生和神经元细胞铁死亡中保持神经保护作用。此外，Vitexin可逆转MCAO/R大鼠模型的脑梗死体积、正常组织病理学和线粒体功能。Vitexin在体外和体内显著降低Nrf2从细胞核到胞质溶胶的转移比率，并调节Keap1/Nrf2/HO-1信号的表达。然而，Vitexin的保护作用被Nrf2抑制剂ML385阻断。这表明，Vitexin保护与Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关的神经元细胞和大脑[62]。在大鼠大脑MCAO/R模型中，淫羊藿次苷II(Icariside II,ICS II）可以减轻缺血性中风小鼠模型的脑损伤，同时改善了长期预后。机制研究显示ICS II直接与Nrf2结合，并在MCAO后增强Nrf2的转录活性。此外，ICS II预处理通过促进Nrf2核转位和激活OXPHOS/NF-κB/铁死亡，对致命OGD暴露后的星形胶质细胞培养物产生细胞保护作用，而Nrf2缺陷小鼠的神经保护作用降低，Nrf2si RNA阻断ICS II的作用。这表明，ICS II通过激活Nrf2进而抑制铁死亡，在脑缺血中发挥神经保护作用[63]。15,16二氢丹参酮I(DHT）是从丹参根中提取的亲脂性丹参酮，具有多种药理作用，DHT在叔丁基氢过氧化物（t-BHP）损伤PC12中减少脂质ROS的产生，增加GPX4的表达和GSH/GSSG的比例，并改善线粒体功能，表明其具有抑制铁死亡功能。沉默后Nrf2,DHT对铁死亡的抑制作用减弱。在p MCAO大鼠中，DHT降低大鼠的神经评分、梗死体积和脑水肿，增加局部脑血流量，改善蛋白质的微观结构，同时DHT激活Nrf2信号传导并抑制p MCAO大鼠。Nrf2激活剂和铁死亡抑制剂对p MCAO大鼠也有保护作用，表明DHT通过激活Nrf2进而抑制铁死亡，在脑缺血中发挥神经保护作用[64]。在大鼠大脑中MCAO/R模型中，黄芪甲苷（astragaloside IV,AS-IV）给药降低梗死体积、脑水肿、神经功能缺损和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB，增加SLC7A11和GPX4的水平，降低脂质ROS水平，并预防神经元铁死亡。同时，AS-IV触发Nrf2/HO-1信号通路，缓解中风诱导的铁死亡。表明，AS-IV通过激活Nrf2进而抑制铁死亡，在脑缺血中发挥神经保护作用[65]。龙血素C(loureirin C,LC）是一种从中国龙血中提取的二氢查尔酮化合物，在缺血再灌注模型中显示出神经保护作用，在小鼠大脑MCAO/R模型中，LC显著减轻MCAO/R后小鼠的脑损伤和抑制神经元铁死亡，此外，LC通过激活Nrf2途径和促进Nrf2的核转位来抑制铁死亡，其增加血红素加氧酶1(HO-1）、醌氧化还原酶1(NQO1）和GPX4的含量。Nrf2敲低减弱LC的抗铁死亡作用，表明，LC通过激活Nrf2进而抑制铁死亡，在脑缺血中发挥神经保护作用[66]。同时，铁死亡抑制剂ferrostatin-1类似物Srs11-92，通过Nrf2信号改善脑缺血/再灌注损伤后的氧化应激和神经炎症[67]。

综上所述，药物通过激活Nrf2在脑缺血体内外模型中，可以通过抑制铁死亡来减轻缺血性脑卒中后神经元损伤，进而改善神经缺损症状，达到治疗缺血性脑卒中脑损伤的作用（Tab.2）。

5、总结与展望

本文概述脑梗死中铁死亡的病理作用机制最新进展，并总结Nrf2激活抑制铁死亡，以及药物通过激活Nrf2进而抑制铁死亡缓解缺血性脑卒中方面的应用进展，为通过靶向激活Nrf2抑制铁死亡来治疗和预防缺血性脑卒中提供了新的靶点。然而，目前关于铁死亡在缺血性脑卒中后脑损伤中作用的研究仍处于初级阶段。对铁死亡如何协调各种细胞事件参与缺血性脑卒中后脑损伤机制的了解相对较少。首先，需要揭示缺血性脑卒中后脑损伤中铁死亡的调节机制。其次，需要确定铁死亡的特异生物标志物，以准确预测抑制铁死亡的效率。此外，大多数数据来自对其临床应用具有深远影响的实验研究，需要更多的临床研究。总之，靶向性抑制铁死亡将为缺血性脑卒中后脑损伤的治疗带来新的方向。

参考文献:

[3] 张海林,陈勇,巴永峰,等.铁死亡调节剂及其在脑卒中中的作用研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2021,26(11):1320-1327.

[6] 张亮,廖勇群,夏秦川,等.铁死亡调控信号通路以及在相关疾病中的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2022,27(2):227-234.

基金资助:内蒙古自然科学基金项目(2021MS08131,2021LHMS08024,2020MS08175,2022MS08046);赤峰市自然科学基金(SZR2023053);

文章来源:李梅,李强.靶向Nrf2-铁死亡通路与缺血性脑卒中后脑损伤治疗研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(02):188-197.