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胃癌发生过程中胃内微生态结构与多样性变化特征

2024-12-17 90 上传者：管理员

摘要：目的通过检测胃癌及胃癌前病变患者胃部微生物，探究从浅表性胃炎到胃癌过程中胃部微生物与胃癌发生的相关性，并寻找可能存在的菌群生物标志物。方法通过纳入及排除标准，分别收集胃癌患者14例和胃癌前病变患者29例(浅表性胃炎8例、萎缩性胃炎9例、肠化生及异型增生12例),采用16S rDNA基因高通量测序检测胃癌患者和胃癌前病变患者胃黏膜菌群，通过PICRUSt预测菌群的功能差异。结果 OTU物种多样性结果显示，胃癌组与癌前病变组胃黏膜样本优化序列数量差异有统计学意义。α多样性结果显示，胃癌患者的Chao指数、ACE指数低于癌前病变患者，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。而β多样性分析结果显示，胃癌组与癌前病变组菌群差异无统计学意义。LEfSe结果表明，在门水平，胃癌组厚壁菌门丰度增加，而变形菌门丰度减少；在属水平，胃癌组毛螺菌属丰度增加，而棒状杆菌、红环菌属、心杆菌属的丰度减少，差异均有统计学意义(LDA>2,P<0.05)。PICRUSt结果表明，胃癌患者与胃癌前病变患者的菌群代谢存在差异，胃癌组中与糖代谢、氨基酸、核苷酸代谢相关的基因富集。结论与癌前病变患者相比，胃癌患者胃黏膜菌群多样性和丰富度发生了特征性改变，在门水平，厚壁菌门为具有显著差异的标志性菌群，而在属水平，胃癌组棒状杆菌属、红环菌属、心杆菌属的丰度也有降低趋势，提示胃癌的发生可能与棒状杆菌属、红环菌属、心杆菌属等菌群的耗竭有关。PICRUSt结果显示，胃癌患者与胃癌前病变患者菌群代谢存在差异。

关键词：
16S rDNA
恶性肿瘤
胃癌
胃癌前病变
胃黏膜菌群
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胃癌是居全球癌症发病谱第5位与死因谱第4位的恶性肿瘤，占所有癌症相关死亡人数的7.7%[1]。胃癌的发生发展是一个复杂的由多种因素参与的过程，随着下一代测序和宏基因组学的发展，强调了胃中也可能存在包括五个主要门在内的不同微生物区系这个事实[2]。目前公认幽门螺杆菌是胃癌的主要危险因素，然而也有研究表明，幽门螺杆菌以外的胃微生物区系可能在胃癌发生的最后几步中起作用[3]。因而本课题拟基于高通量测序探索胃癌患者与胃癌前病变患者胃黏膜菌群的特点，并基于PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)进行功能预测，旨在探究除幽门螺杆菌以外的其他胃微生物区系在胃癌发生中的作用，为后续研究胃黏膜菌群与胃癌发生发展的相互作用奠定基础。

1、资料与方法

1.1研究对象

选取2021年12月至2022年12月就诊于长治医学院附属和济医院内镜室胃部疾病患者43例，其中符合纳入、排除标准的胃癌患者14例，胃癌前病变患者29例，包括浅表性胃炎(superficial gastritis, SG)8例，萎缩性胃炎(atrophic gastritis, AG)9例，肠化生及异型增生(intestinal metaplasia and dysplasia, IM/DYS)12例，各组患者经病理确诊，纳入标准：(1)年龄18～77岁，年龄分布组间无显著不平衡，性别不限；(2)初诊患者，未接受过临床治疗；(3)无严重心、肺、肝、肾等重要脏器疾病史；(4)标本采集前1个月未服用激素、抑酸药、抗生素、免疫抑制剂、微生态制剂等影响胃内菌群的药物；(5)胃癌组患者Karnofsky评分≥60分或ECOG评分≤2分。排除标准：(1)妊娠或哺乳期妇女；(2)有严重未控制的急性感染或内科疾病；(3)有严重的合并症和并发症；(4)胃癌组同时患有其他恶性肿瘤；(5)任何病史，据研究者判断可能干扰试验结果或增加患者风险。所有研究对象均已签知情同意书，并通过了医院伦理委员会的审批(批准号：2023伦审[科]第42号)。

1.2胃黏膜标本采集

所有患者在检查前1 d晚餐后禁食，检查前将二甲硅油散(5 g∶0.3 g)溶于30～50 mL温开水中，于检查前0.5 h内服用完毕。胃镜检查过程中用活检钳在病变最明显处(胃窦、胃体、胃底等，尽量保持同一解剖部位)取胃黏膜组织2块，1块置于90%乙醇中固定，用于组织病理学检测确诊。另1块放入无菌冻存管中，立即保存于-80℃液氮中，待进一步处理。

1.3 16S rDNA测序

采用SDS裂解法进行DNA提取，基因组DNA通过Power Max提取试剂盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)提取，使用1%琼脂糖凝胶检测DNA纯度和浓度。细菌16S rDNA基因V3～V4区采用引物341F:CCTACGGGNGGCWGCAG和反向引物805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC进行PCR扩增，Barcode采用7 bp特定序列合成到引物中。利用PCR产物构建微生物多样性测序文库并评估文库质量，然后在Illumina Novaseq 6000 pair-end 2×150 bp平台进行高通量测序。

1.4生物信息学分析

使用Vsearch v2.4.4对测序平台的下机数据进行拼接得到Raw Tags,同时对序列质量进行质控和过滤，得到最终Effective Tags。对所有样本全部Effective Tags进行聚类，将同源性为97%的序列划分为操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU),并生成稀释曲线，计算丰富度和多样性指数。使用R软件评估不同样本之间的相似性，并根据OTU信息进行聚类分析和主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA),绘制PCoA图。采用线性判别分析效应大小(linear discriminant effect size, LEfSe)方法筛选差异性菌群(以LDA>2为标准进行筛选)。基于PICRUSt进行差异菌群的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)代谢途径功能预测。

1.5统计学方法

运用SPSS 26.0进行统计分析。计数资料用频数描述，计量资料用描述。两组间的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis)分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组胃黏膜菌群的OTU分析

根据聚类从43个样本中共获得15 761个OTU,韦恩图显示胃癌组和胃癌前病变组(SG、AG、IM/DYS)共享OUT 781个(见图1)。随着测序深度的增加，胃黏膜样本菌群稀释曲线趋于平坦(见图2),表明实测数据合理，基本达到测序深度。

2.2两组胃黏膜菌群α多样性分析

两组间α多样性采用Chao指数和ACE指数评估，胃癌组Chao指数低于癌前病变组(216.34±67.05vs798.34±1 139.99,P=0.024),表示胃癌组物种总数低于癌前病变组，胃癌组ACE指数低于癌前病变组(214.08±67.86vs797.69±1 140.43,P=0.02),表示胃癌组群落丰富度低于癌前病变组，两组间差异有统计学意义(见图3～4)。

图1两组菌群OTU分析韦恩图;

图2胃黏膜菌群稀释曲线

图3 Chao指数;

图4 ACE指数

2.3两组胃黏膜菌群β多样性分析

采用Bray-Curtis的PCoA和非加权UniFrac的PCoA法分析两组的胃黏膜菌群结构差异，两种方法均发现胃癌患者的胃黏膜菌群结构与癌前组差异无统计学意义(P>0.05),但值得注意的是非加权UniFrac的PCoA分析法提示胃癌组样本呈现“聚拢”的情况，而癌前病变组的样本是分散的，表明胃癌组微生物群落结构更趋于“同质”。

2.4两组胃黏膜菌群物种门水平结构分析

本研究共检测出24种菌门，两组均以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)为主要优势菌门，与癌前病变组相比，胃癌组厚壁菌门丰度增加，而变形菌门呈减少趋势，差异有统计学意义(P<0.05,见图5)。

图5门水平分类组成图

2.5 LEfSe分析筛选差异菌属

LEfSe分析结果显示，胃癌组厚壁菌门(Firmicutes)、毛螺菌属(Lachnospiraceae)丰度显著高于癌前病变组，而毛螺菌属归属于厚壁菌门，提示胃癌组可能存在厚壁菌门的富集；而棒状杆菌(Corynebacteriales)、红环菌属(Rhodocyclaceae)、心杆菌属(Cardiobacterium)的丰度显著低于癌前病变组，差异均有统计学意义(LDA>2,P<0.05,见图6)。

2.6 KEGG功能预测

通过PICRUSt进行胃癌组与癌前病变组胃黏膜菌群的KEGG通路预测，共发现17个代谢通路有显著差异。其中胃癌组的氨基糖和核苷酸糖的代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、果糖和甘露糖代谢(Fructose and mannose metabolism)等代谢通路表达增强，而癌前病变组的谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、磷脂酰肌醇信号传导系统(Phosphatidylinositol signaling system)等代谢通路表达增强(见图7)。

图6 LEfSe分析两组菌属的LDA值

图7 KEGG预测功能差异

3、讨论

胃癌是一种多因素、异质性疾病。胃黏膜微环境的改变是胃癌发生、发展、转移的必要条件[4]。胃黏膜菌群作为微环境的组成部分，其本身和代谢产物可通过参与新陈代谢、组织发育、炎症、免疫等多种途径来影响肿瘤的生长和扩散[5]。研究表明，在疾病状态下，胃微生物群的丰度和多样性会发生显著变化[6-10],而大多数研究认为胃癌的发生与胃癌患者胃微生物菌群的多样性和丰富度减少相关[7-8,11]。但也有研究表明，胃癌发生过程中胃微生物多样性和丰富度有所增加[12-13]。目前，尚未就微生物群多样性与胃癌发展阶段之间的关系达成共识。

幽门螺杆菌感染一直以来被认为是胃癌发生的主要危险因素，因为该菌有多种与胃癌相关的毒力因子[14],如空泡毒素、细胞毒素相关基因A和外膜蛋白，也可过度表达如IL-1β、IL-8、IL-17和TNF-α等促炎细胞因子[15-16],引起慢性胃炎，进而发展为胃萎缩、肠化生，最终进展为胃肠腺癌[17]。幽门螺杆菌感染显著导致胃微生物生态失调[18]。也有研究表明，乳酸菌[19]和口腔微生物菌群[8]会在胃癌中富集，并被认为会诱发慢性炎症或促进亚硝基化合物的产生，从而促进肿瘤进展。

本研究α多样性分析结果显示，胃癌组Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著低于癌前病变组，而Simpson指数显著高于癌前病变组，表明胃癌发生与胃微生物群落的多样性和丰富度减少相关，这与目前的大多数研究结果相一致[7-8,11]。而β多样性结果显示胃癌组与癌前病变组胃黏膜微生物群落结构无差异，但值得注意的是，胃癌组样本呈现“聚拢”的情况，提示胃癌组微生物群落结构更趋于“同质”,这种“同质”性的结果可能是因为胃癌发生过程中存在某些“优势菌群”承担了这一变化，也可能与本研究两组间的样本量差距有关，或是因幽门螺杆菌的存在而影响微生物组的整体结构[20]。

通过LEfSe筛选差异物种发现，胃癌患者胃黏膜菌群多样性和丰富度发生了特征性改变，在门水平，胃癌组厚壁菌门丰度增加，而变形菌门丰度减少。在属水平，胃癌组毛螺菌属丰度增加，而毛螺菌属是厚壁菌门的重要组成成分，提示胃癌发生过程中可能存在厚壁菌门的富集，这与Ferreira等[11]的研究结果相一致。变形菌门和厚壁菌门是胃癌患者和非胃癌患者胃微生物群的两个优势菌门[21-23],而幽门螺杆菌是变形菌门的主要成分，其丰度与厚壁菌门的丰度呈负相关[11],且目前的观点认为胃癌的发生伴随着幽门螺杆菌定植的逐渐耗竭[24],这可能解释了我们的分析所证明的胃癌组中变形菌门的耗竭和厚壁菌门的富集。值得注意的是，在属水平，胃癌组棒状杆菌属、红环菌属、心杆菌属的丰度也有降低趋势，提示胃癌的发生可能与棒状杆菌属、红环菌属、心杆菌属等菌群的耗竭有关。PICRUSt结果显示，两组菌群代谢存在差异，胃癌组中糖代谢、氨基酸、核苷酸代谢等相关通路富集，与Liu等[21]的研究结果一致，这可能与肿瘤细胞利用氨基酸来产生能量，合成蛋白质和核苷有关，所以糖代谢、氨基酸、核苷酸代谢相关通路的富集与肿瘤细胞的增殖密切相关。

截至目前，已有不少研究表明与健康人群或者癌前病变者相比，胃癌患者的胃部微生物发生了改变，但这些微生物在胃癌发生中的作用机制仍不明确，未来基于胃黏膜菌群在胃癌中的诊断、治疗价值有待进一步研究。

基金资助:国家自然科学基金项目(31900038);山西省重点研发计划项目(社会发展领域)(201903D321032);

文章来源:宋聃,王培龙,赵婉彬.胃癌发生过程中胃内微生态结构与多样性变化特征[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(12):1643-1647.