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胃癌患者血浆PAX5和RNF180基因甲基化情况及其临床意义

2021-06-09 251 上传者：管理员

摘要：目的观察胃癌患者血浆配对盒蛋白5（pairedboxprotein5,PAX5）与环指蛋白180（ringfingerprotein180,RNF180）基因甲基化情况,探讨其与临床病理特征及预后的关系。方法110例胃癌患者为胃癌组,同期体检健康者50例为对照组,采用甲基化特异性PCR法检测血浆PAX5与RNF180基因甲基化状态,分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。随访3年,采用Kaplan-Meier生存曲线分析PAX5、RNF180甲基化与患者预后的关系。结果胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因启动子区甲基化发生率（70.00%、62.73%）高于对照组（32.00%、30.00%）（P<0.05）,胃癌组TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率（65.17%、57.30%）低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者（90.48%、85.71%）（P<0.05）,胃癌组男性与女性、年龄<55岁与≥55岁、肿瘤直径<2.5cm与≥2.5cm、细胞低-中分化与高分化及有无淋巴结转移患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率比较差异均无统计学意义（P>0.05）。发生PAX5基因甲基化的胃癌患者3年生存率（68.83%）低于未发生甲基化患者（84.85%）（P<0.05）,发生RNF180基因甲基化的胃癌患者3年总体生存率（73.91%）与未发生甲基化胃癌患者（73.17%）比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论胃癌患者血浆PAX5与RNF180基因甲基化发生率增高,与肿瘤TNM分期有关,发生PAX5基因甲基化的患者3年总生存率低。

关键词：
DNA甲基化
PAX5基因
RNF180基因
生存率
胃癌
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胃癌为临床常见恶性肿瘤，病死率高，是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。研究[2]发现，幽门螺旋杆菌感染和经常食用腌制品是罹患胃癌的高危因素。胃癌早期临床症状不明显，部分患者发现时已属晚期。因此，尽早诊断与治疗对延长胃癌患者生存期有重要意义。配对盒蛋白5(pairedboxprotein5,PAX5)是一种特异性激活蛋白，在成年人及胚胎组织中广泛表达[3]。PAX5在乳腺癌、食管癌组织中表达下调，具有多种生物学功能[4,5]。环指蛋白180(ringfingerprotein180,RNF180)是E3泛素-蛋白质连接酶的成员，包含RINGfinger和卷曲螺旋结构，通过调节细胞增殖、分化参与肿瘤细胞生长[6]。本研究探讨胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化情况及其与患者临床病理特征和预后的关系，报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2016年7月—2017年5月郴州市第一人民医院诊治的胃癌患者110例为胃癌组，男69例，女41例；年龄45～75(55.4±2.5)岁。纳入标准：(1)胃癌经术后组织病理检查确诊；(2)首次诊断的胃癌，未行放、化疗。排除标准：(1)合并其他消化系统疾病，如胃炎、胃溃疡、食管癌等；(2)合并其他系统恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌等；(3)有免疫功能缺陷疾病；(4)临床资料不完整者。选取本院同期体检健康者50例为对照组，男30例，女20例；年龄42～68(53.2±1.9)岁。2组年龄、性别比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经郴州市第一人民医院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1甲基化特异性PCR(MSP)检测血浆PAX5、RNF180基因甲基化情况

采集2组入选者外周血3mL置于EDTA抗凝管中，离心半径13.5cm,3000r/min离心10min,分离血浆进行后续实验。采用QIAampDNABloodMiniKit(德国Qiagen公司)进行DNA提取，使用紫外分光光度仪检测DNA浓度，符合标准的DNA冻存备用。取2μL进行亚硫酸氢盐修饰，按照EpiTectBisulfiteKit(德国Qiagen公司)说明书进行操作，修饰后的DNA用30μLEB重新溶解，用于MSP检测。引物由美国GENEWIZ公司的北京金唯智公司合成，甲基化的PAX5、RNF180基因引物序列见表1。反应体系：共25μL,包括1μLDNA,Taq酶12.5μL,0.5μLMSP上、下游引物，超纯水10.5μL。反应条件：95℃10min;95℃1min,55℃30s,72℃30s,40个循环。PCR扩增结束后，对扩增产物行质量分数2.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后紫外检测仪下观察并拍照。基因甲基化判断：仅出现甲基化条带而不出现非甲基化条带的样品，判定为基因甲基化；仅出现非甲基化条带而不出现甲基化条带的样品，判定为基因非甲基化；甲基化条带和非甲基化条带均出现的样品，判定为基因甲基化[7]。

表1甲基化的PAX5、RNF180基因引物序列表

1.2.2临床资料采集与随访

根据病历资料，记录患者年龄(≥55岁/<55岁)、性别、肿瘤直径(<2.5cm/≥2.5cm)、分化程度(低-中/高分化)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～Ⅳ期)及有无淋巴结转移等临床病理特征。术后随访3年，自出院日起，1～3个月随访1次，包括门诊或电话随访方式，随访时间3～36个月，随访至终止时间或患者死亡，随访时间截止至2020年5月，记录患者生存情况。

1.3观察指标

(1)比较2组血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率；(2)分析胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率与临床病理参数的关系；(3)分析胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化与预后的关系。

1.4统计学处理

应用SPSS22.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验；PAX5、RNF180基因甲基化情况与胃癌患者预后的关系采用Kaplan-Meier生存曲线分析，比较采用log-rank检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.12组血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率比较

胃癌组血浆PAX5基因启动子区甲基化77例，RNF180基因启动子区甲基化69例。对照组血浆PAX5基因启动子区甲基化16例，RNF180基因启动子区甲基化15例。胃癌组血浆PAX5、RNF180基因启动子区甲基化发生率(70.00%、62.73%)高于对照组(32.00%、30.00%)(χ2=20.394,P<0.001;χ2=14.764,P<0.001)。胃癌组患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化电泳图见图1-2。

图1胃癌组患者血浆PAX5基因甲基化电泳图

图2胃癌组患者血浆RNF180基因甲基化电泳图

2.2胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率与临床病理特征的关系

胃癌组TNM分期Ⅰ、Ⅱ期患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05);不同性别、年龄(<55岁/≥55岁)、肿瘤直径(<2.5cm/≥2.5cm)、分化程度(低-中分化/高分化)及有无淋巴结转移患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率与临床病理特征的关系

2.3胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化与预后的关系

110例胃癌患者均随访成功，无失访病例。随访3年，死亡29例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，发生PAX5基因甲基化的胃癌患者3年总体生存率(68.83%,53/77)低于未发生PAX5基因甲基化的胃癌患者(84.85%,28/33)(χ2=3.626,P=0.028);发生RNF180基因甲基化的胃癌患者3年总体生存率(73.91%,51/69)与未发生RNF180基因甲基化的胃癌患者(73.17%,30/41)比较差异无统计学意义(χ2=2.824,P=0.718)。见图3-4。

图3PAX5基因甲基化与非甲基化胃癌患者Kaplan-Meier生存曲线图

图4RNF180基因甲基化与非甲基化胃癌患者Kaplan-Meier生存曲线图

3、讨论

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，多起源于胃黏膜上皮[8]。手术切除是治疗胃癌的有效方法，但晚期胃癌患者因血液及淋巴结的转移等，患者预后差。因此，了解胃癌发生、发展的分子机制，研究新的治疗靶点对改善患者预后有重要意义。

PAX5是配对盒基因家族的成员之一，位于染色体9p13,在机体代谢过程中发挥重要生物学作用，如参与器官发育、调控组织细胞的增殖及分化[9]。PAX5广泛表达于正常上皮组织及肿瘤组织中[10]。研究[11]表明，肝细胞癌PAX5被启动子高甲基化导致基因沉默。研究[12]显示，PAX5是胃癌进展过程中一种新的肿瘤抑制因子，PAX5启动子的甲基化与胃癌患者的生存情况有关。本研究结果显示，胃癌组患者血浆PAX5基因启动子区甲基化发生率高于对照组，胃癌组TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者血浆PAX5基因甲基化发生率低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；说明胃癌患者PAX5基因甲基化发生率增高，与胃癌患者TNM分期有关；提示PAX5基因启动子区甲基化可能参与胃癌的发生、发展。PAX5可抑制Wnt信号通路中β-catenin的信号传导，下调下游靶基因人髓细胞增生原癌基因和cyclinD1表达，阻止细胞进入S期，抑制肿瘤细胞增殖。当PAX5基因发生启动子区甲基化时，沉默了PAX5基因的生物学功能，加快肿瘤细胞的生长周期，抑制肿瘤细胞凋亡，减少肿瘤细胞凋亡数量，促进肿瘤细胞增殖和分化，提高肿瘤细胞的恶性程度，进而影响胃癌进展。此外，甲基化的PAX5沉默了PAX5的抗肿瘤功能，通过下调抑癌基因p53、p21,可促进肿瘤细胞增殖和组织生长，上调B细胞淋巴瘤/白血病-2基因和基质金属蛋白酶-1表达，促进肿瘤细胞增殖、分化、浸润和转移，提高肿瘤细胞的恶性程度[13]。

RNF180基因参与了E3泛素蛋白酶系统的构建，是泛素蛋白连接酶，参与泛素的降解[8]。RNF180参与多种生物学过程，如DNA修复、基因转录和细胞凋亡等多种细胞过程。当RNF180基因发生启动子区甲基化可改变染色质结构，对多种疾病具有负面影响，如代谢异常、出现肿瘤(如肾细胞癌),通过参与细胞增殖、分化、凋亡等过程调节肿瘤细胞的生长[14]。本研究结果显示，胃癌组患者血浆RNF180基因启动子区甲基化发生率高于对照组，胃癌组TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者血浆RNF180基因甲基化发生率低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；说明胃癌患者RNF180基因甲基化发生率高，TNM分期晚，提示RNF180启动子区的甲基化参与了胃癌的发生、发展。RNF180可通过上调凋亡介质基质金属蛋白酶组织抑制因子3和CDKN2A的表达，促进肿瘤细胞凋亡，对肿瘤生长有一定抑制作用。RNF180启动子区发生甲基化时，引起RNF180基因结构发生改变、功能异常，其促凋亡作用减弱甚至丧失，对肿瘤的增殖和分化无明显抑制作用，间接促进肿瘤细胞的生长、分化及转移[15]。研究[16]表明，泛素-蛋白酶体途径的异常激活可加速胃癌组织中IκBα降解，上调核转录因子-κB表达，与癌细胞淋巴结转移密切相关，推测RNF180作为E3泛素连接酶的成员，可能参与了上述分子过程，从而促进胃癌淋巴结转移，提高肿瘤临床分期。本研究Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，发生PAX5基因甲基化的胃癌患者术后3年生存率低于未发生甲基化患者，发生RNF180基因甲基化患者术后3年生存率与未发生甲基化患者比较差异无统计学意义；说明PAX5基因甲基化与胃癌患者术后不良预后相关，有可能成为预测胃癌患者预后的指标。

本研究结果提示，胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率均增高，与肿瘤TNM分期有关，PAX5基因甲基化有助于评估胃癌患者的预后情况。但本研究为回顾性分析，样本量小，确切结论尚需扩大样本量进一步研究证实。

参考文献：

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[3]景彩霞,冯钰,曹霞,等.SOX11､PAX5在套细胞淋巴瘤患者病理组织标本中的表达及临床意义[J].四川大学学报(医学版),2020,51(3).355-360

[7]曹长琦,常琳,吴齐.SEPT9与RNF180基因甲基化检测在早期胃癌筛查中的诊断价值[J].中国肿瘤临床,2019,46(24):1251-1255.

[8]张云,姚萍,崔旻,等.临床病理特征与早期胃癌分化程度的关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2019,33(5):443-445.

[9]曹石,李文生.PAX-5在非淋巴造血系统肿瘤中的研究进展[J].临床与病理杂志,2018,38(8):1775-1779.

[15]王海光,姜华茂,左知润,等.RNF180启动子区甲基化在前列腺癌中的作用机制[J].中国医科大学学报,2017,46(6):561-565.

文章来源：谭智军,赵玉国,肖晓艳.胃癌患者血浆PAX5和RNF180基因甲基化情况及其临床意义[J].中华实用诊断与治疗杂志,2021,35(06):584-587.

基金：湖南省科技计划项目(2016JJ0128)