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基于PI3KAKTmTOR信号通路研究复方蜥蜴散凝胶对胃癌前病变模型大鼠的调控作用

2021-09-27 171 上传者：管理员

摘要：目的:基于PI3K/Akt/mTOR信号通路研究复方蜥蜴散凝胶对单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍诱导的胃癌前病变模型大鼠的调控作用。方法:采用MNNG溶液配合饥饱失常及情绪刺激等综合因素制备胃癌前病变模型。造模成功后将其随机分为模型组、维酶素组(7g•kg-1)及复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组,另设空白组,连续给予相应的药物12周。HE染色观察大鼠胃组织病理变化;WesternBlot检测大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达。结果:与模型组比较,复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达显著下调（P<0.05）;胃组织病理损伤有所改善。结论:复方蜥蜴散凝胶治疗胃癌前病变疗效确切,可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

关键词：
PI3K/AKT/mTOR信号通路
复方蜥蜴散凝胶
大鼠
胃癌前病变
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胃癌前病变指在慢性萎缩性胃炎基础上伴肠上皮化生和异常增生的疾病，是正常胃黏膜向胃癌逐步转化的过程，具有临床表现不典型、发病不明显、病程迁延难愈等特点[1]。研究发现，PLGC的发生与饮酒、喜食腌制食物、饮食不规则、喜食油煎食物、喜食辛辣食物、幽门螺杆菌感染、消化道肿瘤家族史、焦虑、抑郁等危险因素密切相关[2]。研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路在胃癌细胞中出现异常活化。当肿瘤细胞的生存环境有压力时，该通路被激活，参与调节细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、血管生成和周期运行[3]。因此，PI3K/AKT/mTOR信号通路被认为是在外环境压力下细胞生存的关键调节因素[4]。本研究将通过单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍配合饥饱失常及情绪刺激综合因素诱导大鼠PLGC模型，观察复方蜥蜴散凝胶对大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，为中医药治疗PLGC提供新思路。

1、材料

1.1动物

SPF级健康雄性SD大鼠120只，许可证号：SCXK(宁)2015-0001,6～8周龄，体质量180～220g,由宁夏医科大学实验动物中心提供，饲养于宁夏医科大学SPF级动物房，16h/8h:光照/黑夜循环，温度(22±2)℃,湿度45%～50%,自由饮食饮水。

1.2药物与试剂

复方蜥蜴散凝胶(由宁夏密点麻蜥15g,黄芪30g,党参15g,山药15g,白术15g,元胡10g,枳壳15g,砂仁10g,旋覆花10g,佛手10g,白芍15g,乌梅10g,半夏10g组成，由宁夏医科大学中医消化病研究所提供);维酶素(乐普恒久远药业有限公司，批号：H41024448)。MNNG(日本东京化成工业株式会社，批号：8WF3N-LC));磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3kinase,PI3K)抗体(北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0128R);AKT抗体(北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0115R);哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-1992R);BCA蛋白定量试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：KGPBCA);TBST(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：p25133);ECL发光液(南京凯基，货号：KGP1127);PVDF膜(Millipore公司，货号：IPVH00010);蛋白marker(美国Thermo公司，货号：26616);Tris(日本Biofount公司，货号：SS1426)。

1.3仪器

电热恒温培养箱(南京实验仪器厂，型号：HH.B11.600);冷冻离心机(德国Eppendorf公司，型号：centrifuge5417R);光镜(日本Olympus公司，型号：CKX41);旋涡混合器(美国SI公司，型号：SI-0246);切片机(德国Leica公司，型号：RM2016);电泳仪(美国Bio-Rad公司，型号：1658033);凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司，型号：XR+)。

2、方法

2.1动物分组与模型制备

将健康SPF级SD雄性大鼠120只，随机分为6组，即空白组、模型组、维酶素组、复方蜥蜴散凝胶(高、中、低剂量)组，每组20只。除空白组外，其余各组大鼠连续24周灌胃0.02mol·L-1MNNG溶液(5g·kg-1)及加入等浓度的MNNG溶液自由饮用，辅助采取2日饱食、1日饥饿的饥饱失常法，饱食日自由饮食，饥饿日禁食不禁水，配合情绪刺激复制PLGC模型[5,6,7],空白组大鼠给予同体积蒸馏水饮用。

2.2模型鉴定及给药

除空白组外，其余组随机抽取3只大鼠，杀检，取病变胃黏膜，进行HE染色。若杀检大鼠胃黏膜出现炎性细胞浸润，杯状细胞增多，腺体减少、萎缩及排列不规则等病理变化，则为PLGC模型复制成功。

复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组分别以28g·kg-1、14g·kg-1、7g·kg-1灌胃，维酶素组以7g·kg-1灌胃，空白组和模型组大鼠给予同体积生理盐水灌胃，每天1次，连续给药12周。

2.3HE染色观察大鼠胃组织病理变化

每组随机选取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液(3g·kg-1),将其麻醉处死后，剖腹，在距贲门和幽门1.5cm处分离出全胃，沿胃大弯侧切开，生理盐水冲洗，滤纸吸干铺开，肉眼观察胃黏膜的色泽形态、有无糜烂出血及增生等，然后从胃底处取2cm×3mm纵切条状组织，置于40ng·L-1多聚甲醛固定24h,梯度脱水后，石蜡包埋，对其进行脱蜡：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡各10min;入水：乙醇100%乙醇Ⅰ和Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇各5min→自来水冲洗5min→苏木素染色10min→自来水冲洗30min→盐酸乙醇分化15s→自来水冲洗30min→伊红染色5～8min;过水；脱水：70%乙醇1min→80%乙醇1min→90%乙醇5min→95%乙醇5min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5min;透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10min;中性树脂封片；显微镜下观察大鼠胃组织病理变化[8,9,10]。

2.4WesternBlot法检测大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达

每组选取6只大鼠的胃组织，将病变胃组织胃体部剪碎，加入裂解液30min后，4℃,13000rpm·min-1离心5min,吸取上清，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取总蛋白沸水浴加热变性后，取25μL上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶电泳；蛋白电泳分离后移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1h;置一抗稀释液中，4℃过夜；洗涤3次，置二抗稀释液中，室温孵育1h;显色，以β-actin蛋白表达为参照，Image-proplus(Version4.1)系统采集数据，图像分析系统的光密度值为条带灰度密度值和相应的β-actin灰度密度值的比值作为指标进行结果分析[11]。实验重复3次。

2.5统计学方法

采用SPSS21.0软件对数据进行处理，计量资料采用均值±标准差(x¯±s)表示，多组间比较采用方差分析。假设检验采用双侧检验，取α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1对大鼠一般行为的影响

除空白组，模型组大鼠出现大便不成形、精神状态萎靡、扎堆少动、毛色晦暗无泽；复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠的粪便成颗粒状、精神状态佳、活跃、毛色光洁。

3.2对大鼠胃组织病理变化的影响

空白组大鼠胃黏膜表面光滑平整，腺体结构完整清晰可见，排列整齐，细胞形态正常，无炎性细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜组织及腺体萎缩，细胞形态改变，杯状细胞增多，大量炎性细胞浸润，排列紊乱不规则；复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠胃黏膜组织病理表现有痊愈趋势，腺体增多，排列规则，炎性细胞及杯状细胞浸润减少，其中以复方蜥蜴散凝胶高剂量组最为明显。见图1。

3.3对大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达显著上调(P<0.05);与模型组比较，复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达显著下调(P<0.05)。

4、讨论

PLGC的发生、发展过程中，脾胃虚弱贯穿于其病程的始末[12]。脾胃为后天之本、气血生化之源，与机体的正气盛衰和抗病能力密切相关。MNNG溶液作为外来邪气侵袭，当受到饥饱及情绪失常等因素刺激时，可致大鼠脾胃虚弱，加之失于调养，致脾胃不能腐熟水谷，通降功能失常，出现食入不化，胃气上逆，呕吐清水并夹杂不消化食物，最终导致气血生化乏源，出现形体枯槁，生理功能失常等一系列病理变[13]。此外，中气亏虚、气虚不足以行血，则血行迟缓，逐渐壅滞成瘀，瘀血日久致各种毒素产物堆积。胃肠道动力的异常，黏膜失养而致其增生等，从而诱导PLGC的发生[14]。采用宁夏本土道地药材密点麻蜥为主要药物组成的复方蜥蜴散凝胶，有益气养血、化瘀解毒之功效，可起到抗癌、抑癌、阻癌的治疗效果。研究表明，宁夏密点麻蜥对胃肠道有亲和力和靶向作用，可修复甚至逆转胃肠道损伤的黏膜[15],治疗PLGC临床效果显著。以凝胶为给药形式，使药物能够很好地黏附在胃黏膜上，形成保护膜，促进黏膜修复，创新蜥蜴散剂的给药形式[16]。

研究表明，P13K/AKT/mTOR信号通路与细胞增殖关系密切，可能与肿瘤的发生发展密切相关[17],在细胞的生理病理活动过程中发挥至关重要作用[18]。研究发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路在胃癌细胞中出现异常活化，上游信号刺激时，PI3K活化，激活AKT,活化的AKT可直接激活mTOR,使其发生磷酸化，参与调控生物大分子如蛋白质、核苷酸、脂质等的合成过程，为肿瘤细胞生长提供了必要的物质基础[19,20]。PI3K蛋白是信号通路的重要组成分子，是一种在肿瘤细胞质与细胞核阳性表达的复合体，可参与细胞迁移等，还可调控肿瘤细胞的糖酵解过程[21,22]。蛋白激酶B(proteinkinaseB,PKB)是一种丝氨酸苏氨酸激酶，对肿瘤细胞的存活及凋亡起到重要作用。AKT能促进葡萄糖转运子的膜转位，增加葡萄糖摄取，促进糖酵解[23,24]。mTOR是细胞生长和增殖的重要调节因子，为PI3K/AKT/mTOR信号通路中下游的重要激酶之一，参与肿瘤细胞存活、增殖、侵袭与迁移等。研究发现，mTOR蛋白在癌肿细胞的细胞核中过度活化，通过调节核苷酸、葡萄糖等生物小分子的摄取，改变mTOR信号中某些关键代谢酶的结构，影响癌肿组织的生长及代谢[25,26,27]。PI3K/AKT通过激活下游靶点mTOR,诱导上皮间质转化的发生，促进肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶，进而降解、破坏细胞外基质，使肿瘤细胞脱离原发部位而发生侵袭和转移[28]。P13K/AKT/mTOR信号通路不但参与调控肿瘤细胞增殖与凋亡，还与血管生成密切相关。血管生成是肿瘤赖以生长、转移并具有致死性的基础[29]。

本实验结果显示，复方蜥蜴散凝胶高剂量组药效明显优于其他组，可有效缓解PLGC模型大鼠的症状，其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关，通过调控此通路，干预细胞的上皮-间质转化，改善黏膜外环境，以平衡胃黏膜细胞异常增殖凋亡，防止细胞过度增殖分化，使机体处于“阴平阳秘”,三焦气化功能正常，提高机体抗邪能力，为胃黏膜组织细胞功能的恢复提供有利环境[30],从而阻断PLGC的发生。

参考文献：

[1]许婉，刘宁宁，朱梅萍，等.中医药防治胃癌研究进展[J].世界华人消化杂志，2019,27(10):637-642.

[2]杨彬，龙晓奇，陈瀚，等.胃癌癌前病变的高危因素调查研究[J].川北医学院学报，2019,34(5):632-634.

[3]潘理会，张平，李春辉.PI3KIAKT/mTOR信号传导通路在胃癌中的研究进展[J].承德医学院学报，2016,33(4):324-327.

[4]徐余超.PI3KIAKT/mTOR通路关键信号分子在胃癌组织中的表达及意义[D].南京:东南大学，2017.

文章来源：王艺臻,王佳林,朱西杰.基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究复方蜥蜴散凝胶对胃癌前病变模型大鼠的调控作用[J].中医学报,2021,36(10):2154-2158.