脊髓损伤是由外界直接或间接因素导致的，在损害的相应节段出现运动、感觉丧失和肌张力异常及病理反射等异常改变，给患者及其整个家庭带来极其沉重的精神心理及经济压力[1]。权威研究报道，2016年全球脊髓损伤患者新增27000000例，国内新增脊髓损伤患者4339654例，主要由于高处坠落和交通意外造成[2]。目前脊髓损伤的常规治疗方法主要有手术治疗、牵引固定非手术治疗、激素神经营养物质等药物治疗，但是效果不佳。那么，如何实现神经轴突的再生和脊髓功能的重建，仍是脊髓损伤治疗中面临的最大挑战。近年来，以干细胞为代表的细胞生物技术在脊髓损伤修复中发挥巨大作用，具有独特优势，引发科研人员与医务工作者的广泛关注，已经开展大量临床前实验。中国已有3个临床备案和4个中国临床中心注册的干细胞治疗脊髓损伤项目，其干细胞种类均为间充质干细胞，间充质干细胞治疗脊髓损伤表现出了巨大的潜力和应用前景，为脊髓损伤患者的运动、感觉功能重建带来了新的曙光。

间充质干细胞是目前最具有应用前景的一类干细胞，自体/异体移植免疫排异反应极低，并且制备技术成熟、生产监管要求明确。间充质干细胞具有多种生物学功能和广泛的组织再生修复潜能[3]，可以归巢迁移到损伤区域并与受损组织结合[4]，通过分泌各种神经营养因子、细胞因子和/或通过靶细胞上的特定受体激活信号通路，介导免疫调节、抗凋亡和抗炎作用。多项研究证实间充质干细胞具有促进脑和脊髓神经组织再生能力，支持间充质干细胞具有治疗神经退行性疾病和创伤性脑脊髓损伤的潜力[5,6]。

目前，间充质干细胞疗法的临床前研究通常使用小型实验动物(大鼠、小鼠)作为模型，检测受损组织的结构和功能恢复情况。然而，小动物和人类种属差异大，小动物实验结果不能准确反映与预测人类研究结果，因而对临床试验的支撑、指导效果不甚理想[7]。因此，科研人员将目光转向非人灵长类动物和其他大型动物(如猪、狗和猴)，将其作为中间临床前模型，承启啮齿类小动物模型结果与人类临床试验，期待获得更为准确的实验数据支持，研发更有效的治疗方法，为揭示疾病机制、药物开发、生物组织工程以及电生理和康复研究提供更广阔的平台[8]。因此，该研究筛选了应用大动物模型开展间充质干细胞治疗脊髓损伤的相关文献，并在此基础上进行数据提取、结果评价和Meta分析。

1、资料和方法

1.1 文献检索

计算机检索PubMed、Cochrane、OVID、WebofScience和中国知网，检索时限从建库起至2019年12月，检索关于间充质干细胞治疗大动物脊髓损伤的系列研究。采取主题词与自由词组合的方式检索，PubMed英文检策略：((myelopathy,traumatic)OR(injuries,spinalcord)OR(post-traumaticmyelopathy)OR(spinalcordcontusion)OR(spinalcordlaceration)OR(spinalcordtransection)OR(spinalcordtrauma)OR(contusion,spinalcord)OR(contusions,spinalcord)OR(cordcontusion,spinal)OR(cordcontusions,spinal)OR(cordinjuries,spinal)OR(cordinjury,spinal)OR(cordlaceration,spinal)OR(cordlacerations,spinal)OR(cordtransection,spinal)OR(cordtransections,spinal)OR(cordtrauma,spinal)OR(cordtraumas,spinal)OR(injury,spinalcord)OR(laceration,spinalcord)OR(lacerations,spinalcord)OR(myelopathies,post-traumatic)OR(myelopathies,traumatic)OR(myelopathy,post-traumatic)OR(posttraumaticmyelopathy)OR(post-traumaticmyelopathies)OR(spinalcordcontusions)OR(spinalcordinjury)OR(spinalcordlaceration)OR(spinalcordtransections)OR(spinalcordtraumas)OR(transection,spinalcord)OR(transections,spinalcord)OR(trauma,spinalcord)OR(traumas,spinalcord)OR(traumaticmyelopathies)OR(traumaticmyelopathy))and((MSC)OR(mesenchymalstemcell))and((swine)OR(monkey)OR(canine)OR(dog)OR(primate)or(pig))；中文检索词：“脊髓损伤”“间充质干细胞”“猪”“狗”“犬”“猴”。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 研究类型

随机对照实验(randomizedcontrolledtrials,RCTs)或半随机对照实验(quasi-RCTs)，发表语种为中文或者英文，无论是否使用盲法。

1.2.2 纳入标准

研究对象为脊髓损伤的大动物模型，包括犬类、猪、猿类、猴子等。干预措施为实验组采取间充质干细胞治疗，包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，对照组采取空白对照、生理盐水或PBS治疗。

1.2.3 排除标准

(1)非中英文文献；(2)重复发表的文献；(3)只有摘要无全文的文献；(4)未设置对照组或数据不全；(5)文献统计学方法使用错误；(6)实验动物为非大动物，如小鼠、大鼠、兔等。

1.3 文献质量评价

由2名研究者独立按照纳入和排除标准筛选文献，并对纳入研究的基线资料进行提取整理，包括纳入研究的文献题目、第一作者、发表时间、动物种类、干预分组、每组动物例数、研究类型、评价时间、结局指标。文献资料提取完成后由2名研究者交叉核对，对于有分歧的纳入研究，交给第3名研究者协助判定。纳入研究的偏倚风险评价采用SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具(SYRCLE’sriskofbiastoolforanimalstudies)推荐的10个条目进行评价[9]，评估结果以“是”“否”和“不确定”分别代表低偏倚风险、偏倚风险和不确定偏倚风险。

1.4 结局指标

有效性指标：(1)Olby运动评分；(2)损伤部位面积；(3)损伤部位胶质纤维酸性蛋白表达。

1.5 统计学分析

采用Stata16.0软件进行数据提取及Meta分析。术后运动评分、损伤部位大小和胶质纤维酸性蛋白的表达量为连续性变量，采用均数差(meandifference,MD)或标准化均数(standardmeandifference,SMD)及95%CI表示。采用Q检验和I2值判断研究间异质性，当异质性较小时(P>0.1,I2<50%)，采用固定效应模型；若异质性较大时(P≤0.1,I2≥50%)采用随机效应模型。P<0.05时两组间差异有显著性意义。发表偏倚利用基于回归的Egger检验，P≥0.05时，无发表偏倚，同时进行敏感性分析。

2、结果

2.1 检索结果分析

根据检索策略，共检索出相关文献542篇，通过NoteExpress软件排除重复文献44篇，剩下的文献通过阅读题目、摘要和全文，排除不符合要求文献488篇，最终纳入文章10篇[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19]，详见图1。

2.2 基线分析及质量评价

共纳入10个研究，共108只动物，治疗组61只，对照组47只。8个研究对象为比格犬[10,11,12,14,15,16,17,18]，其余2个研究对象分别为小型猪和恒河猴[13,19]，均为大动物脊髓损伤模型，3个研究运用脂肪间充质干细胞，1个研究运用脐带间充质干细胞，其余6个研究运用骨髓间充质干细胞，纳入研究的基线特征见表1，根据SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具进行质量评价，见表2。

图1|文献筛选流程图

2.3 Meta分析结果

2.3.1 运动功能的Meta分析

5个研究报告了脊髓损伤后间充质干细胞对大动物运动功能的影响[10,11,12,16,18]，运用Olby评分表进行评价，其中1个研究包含自体移植和异体移植2个实验组[18]，因此对运动功能的分析包括6个研究，合计标本量为84只动物，实验组和对照组各42只。各研究结果之间异质性较高，选择随机效应模型，结果显示间充质干细胞治疗组的运动评分明显高于对照组[I2=97.73%,MD=3.94,95%CI(2.15,5.72),P<0.01]，见图2。根据不同细胞来源、观察时间、移植时机、移植方式和移植类型分不同的亚组进行分析。结果显示：(1)在细胞来源方面，骨髓间充质干细胞和非骨髓间充质干细胞来源组的运动评分均明显高于对照组，差异有显著性意义，MD=4.23和3.58,95%CI分别为1.53-6.93,0.84-6.33;(2)在观察时间方面，短时间观察(<2个月)和长时间观察(≥2个月)的间充质干细胞治疗组的运动功能评分均高于对照组；(3)在大动物模型急性期进行移植组运动评分高于对照组[MD=3.09,95%CI(0.59-5.59),P<0.01]，同样，在非急性期移植组也有相似结果，运动评分明显高于对照组[MD=4.55,95%CI(1.91-7.19),P<0.01];(4)与支架复合移植组运动评分相较对照组，差异无显著性意义[MD=2.64,95%CI(0.88-4.41),P=0.10]，而单纯细胞移植组的运动评分明显高于对照组[MD=4.35,95%CI(1.98-6.72),P<0.01];(5)在移植类型方面，因5个研究为异种移植，异种移植组的运动评分高于对照组[MD=4.28,95%CI(2.30-6.26),P<0.01]，而同种移植只有1项研究，无其他统计结果。具体数据详见表3。

表1|纳入研究的基本特征

表2|纳入研究的偏倚风险评价结果

图2|运动功能的Meta分析结果

5个研究报告了造模后间充质干细胞对大动物模型脊髓损伤部位大小的影响[13,14,15,18,19]，合计标本量为54只动物，实验组为29只，对照组25只。各研究结果之间异质性较高，选择随机效应模型，结果显示间充质干细胞治疗组的损伤尺寸明显小于对照组[I2=98.05%,MD=-1.00,95%CI(-1.95,-0.04),P=0.04]，见图3。

2.3.2 胶质纤维酸性蛋白表达水平的Meta分析

4个研究报告了间充质干细胞对大动物脊髓损伤后组织中胶质纤维酸性蛋白的表达[12,14,15,16]，运用Westernblot或PCR检测损伤部位中胶质纤维酸性蛋白的相对表达量。合计标本量为30只动物，实验组和对照组分别为15只。各研究结果之间异质性较高，选择随机效应模型，结果显示间充质干细胞治疗组与对照组之间胶质纤维酸性蛋白相对表达量差异无显著性意义[I2=99.48%,MD=80.61,95%CI(-27.48,188.70),P=0.14]，见图4。

2.3.3 发表偏倚的检测

运动功能分析中纳入6个研究，发表偏倚检验结果：t=0.60,P=0.546，不存在发表偏倚；损伤部位大小分析中纳入5个研究，发表偏倚检验结果：t=-3.3,P=0.046，存在发表偏倚；胶质纤维酸性蛋白表达水平分析中纳入4个研究，发表偏倚检验结果：t=-0.81,P=0.501，不存在发表偏倚。2.3.5敏感性分析对异质性大的结局指标通过逐一删除研究、转换效应模型等方法进行敏感性分析，I2差别不明显，考虑与研究纳入模型的疾病严重程度、方法学等方面相关。

3、讨论

脊髓损伤是脊柱外科一种常见的创伤性疾病，导致神经元死亡、功能性运动和感觉丧失，通常会引起损伤面以下躯体感觉与功能的严重障碍，丧失生活自理能力。脊髓损伤具有发病率高、治愈率低、致残率高、并发症多的特点，给患者、家庭、社会带来沉重的医疗压力与经济负担。脊髓损伤病理生理过程中最关键的阶段是继发性损伤，即随后发生的不受控制的破坏性级联反应，伴随着异常的分子信号、炎症、血管变化和继发性细胞功能障碍。脊髓损伤后的面积或体积可直接代表损伤程度，而脊髓损伤运动功能评分则标志着功能损伤程度，且不同类型动物具有不同的评分系统，如评价小鼠的BMS评分系统[20]、大鼠的BBB评分系统[21]、大动物的Obly评分等[11]。胶质纤维酸性蛋白基因激活和蛋白诱导在中枢神经损伤和神经退行性变后星形胶质细胞活化中起着重要作用。在创伤性脑损伤和脊髓损伤之后，胶质纤维酸性蛋白及其分解产物迅速释放，使其成为此类神经系统疾病的有力候选生物标记物[22]。ROPPER等[23]在脊髓损伤后通过免疫荧光和Westernblot测量损伤部位胶质纤维酸性蛋白的表达水平，结果显示间充质干细胞和支架组在移植早期可以明显减低胶质纤维酸性蛋白的表达，与损伤部位星形胶质增生状态和严重程度相关。

表3|间充质干细胞对脊髓损伤后运动功能改善的亚组分析

图3|损伤部位大小的Meta分析结果

图4|胶质纤维酸性蛋白表达的Meta分析结果

间充质干细胞的应用是最重要、最有前途的治疗策略之一[6]。在大鼠脊髓损伤模型中，间充质干细胞可促进抑炎型M2巨噬细胞增多，维持促进再生的局部环境，进而促进修复[24]，同时可抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达，增强白细胞介素10、脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子的表达，具有抗炎和营养神经的作用，改善损伤引起的疼痛[25]。

然而，临床前研究主要集中在小动物模型上，大量啮齿类(如大鼠、小鼠)动物实验表明间充质干细胞可以改善脊髓损伤的功能修复[26,27,28,29,30,31,32]。虽然啮齿动物是研究脊髓损伤机制和治疗发展的宝贵模型，但大型哺乳动物，特别是非人灵长类动物，与人类的体型、神经解剖学和生理学更为相似，其结果更为可靠。该研究聚焦于大动物脊髓损伤模型，分析间充质干细胞的疗效，为临床转化提供更可靠的依据。实验研究表明，比格犬急性脊髓损伤后给予间充质干细胞治疗，免疫荧光发现间充质干细胞可分化为NF160和NeuN阳性的神经元细胞，进而提高运动评分，改善运动功能[30]。

共纳入10个研究进行Meta分析，以运动评分、损伤部位面积和胶质纤维酸性蛋白的表达水平作为评价指标。在运动功能修复方面，结果显示间充质干细胞可以明显提高脊髓损伤后运动评分[95%CI(2.15,5.72),P<0.01]，这与既往在小动物实验的结果一致。这可能与间充质干细胞释放各种神经营养因子有关，提供适当的微环境，从而促进功能恢复，绝大多数研究表明间充质干细胞能在一定程度上改善运动功能。根据不同细胞来源分类进行亚组分析表明无论骨髓间充质干细胞或非骨髓间充质干细胞均可改善运动功能，但二者功能评分的95%CI相近[(1.53-6.93)vs.(0.84-6.33)]。有研究将脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗中、重度小鼠脊髓损伤模型，结果显示在中度损伤模型中，脂肪间充质干细胞促进CD31阳性血管内皮细胞增殖，PKC阳性皮质脊髓束轴突增多，进而增加神经保护作用，促进功能恢复，并且优于骨髓间充质干细胞；而2种干细胞在重度损伤模型治疗中没有明显作用[33]。RYU等[30]将来源于脂肪、骨髓、华通胶的间充质干细胞用于治疗比格犬脊髓损伤，结果显示不同来源间充质干细胞对运动功能均有改善，明显优于对照组，并且脐带间充质干细胞具有更明显的神经保护作用和炎症抑制作用。在移植时机亚组中，间充质干细胞对急性期和非急性期脊髓损伤都有良好的作用，在非急性期的优势更为明显，这可能是在脊髓损伤的继发损伤中，间充质干细胞发挥了更大的作用[8]。此外，该研究显示单纯细胞移植治疗对运动功能的修复作用更优，与LI等[34]认为干细胞复合胶原支架效果更佳不符。这可能与造模方式有关，复合支架移植组多为脊髓横断法造模，脊髓损伤较重，而单纯移植组多为脊髓压迫或钳夹法造模，需更多相关研究证实。

在对局部脊髓损伤部位的修复作用分析中，结果显示间充质干细胞可明显促进损伤修复，减少损伤面积[95%CI(-1.95,-0.04),P=0.04]，这一结果与运动功能的改善相一致。间充质干细胞移植后可减少损伤部位炎性因子的表达和增加神经营养因子的表达[35],MUNISWAMI等[36]发现间充质干细胞移植后可表达多类神经细胞标记物，如MAP2、NF、NeuN，从而向神经方向分化，这些作用都可促进损伤修复，减小损伤面积。胶质纤维酸性蛋白为炎症引发反应性星形胶质细胞增多的标志物，间充质干细胞注射可以减少损伤部位胶质纤维酸性蛋白的表达[25,37,38]，在大鼠脊髓损伤模型中给予人间充质干细胞和支架治疗组的表达量最低[23]。KRUPA等[33]研究显示脐带间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤可明显减低胶质纤维酸性蛋白在基因水平的表达，减少胶质瘢痕化。但该研究中间充质干细胞组与对照组相比较，胶质纤维酸性蛋白的表达水平并无明显差异，可能与分析中纳入研究较少有关。

此次研究的不足之处：(1)目前尚缺乏规范的动物实验Meta分析的质量评价体系，该研究文献质量评价无标准定量；(2)纳入文献的部分结局指标存在发表偏倚，敏感性分析结果显示模型稳定性稍差，可能由于研究样本量太少所致，若想获得研究结果的可靠性，仍需大样本、高质量的文献研究纳入分析。

综上所述，通过Meta分析表明，间充质干细胞可以有效改善大动物脊髓损伤运动功能，促进损伤部位修复，对进一步开展临床研究有指导意义。基本可以肯定，间充质干细胞在脊髓损伤的治疗中发挥着积极、有效的作用，今后有待开展临床试验对安全性、有效性进行进一步评估。但受纳入研究质量所限，该研究结论尚需更多高质量的研究加以验证。

参考文献：

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[32]潘晓明,吴玲玲,陈浩浩,等.脐带间充质干细胞移植对脊髓损伤小鼠运动功能的修复和镇痛作用[J].解剖学杂志,2020,43(1):3-9.

孔德胜,何晶晶,冯宝峰,郭瑞云,AsiamahErnestAmponsah,吕飞,张舒涵,张晓琳,马隽,崔慧先.间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J].中国组织工程研究,2021,25(07):1142-1148.

基金:河北省高层次人才资助项目(B2019005009),项目负责人:孔德胜;国家自然科学基金青年项目(81801278),项目负责人:马隽;河北省自然科学基金面上项目(H2019206637),项目负责人:马隽.