结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的一种慢性传染病。在许多国家和地区，结核病仍然是导致疾病和死亡的一个重要原因[1]。高效、准确的诊断是防治结核病最有效的方法之一。结核病临床诊断方法主要包括Mtb镜检、Mtb培养、干扰素释放试验(IGRA)等，但这些方法或不敏感或耗时久[2,3]。生物标志物能在短时间内观察到，并且可以替代并合理预测临床相关终点或难以观察的中间结果，因此广泛运用于疾病的诊断和治疗，如支气管哮喘、系统性红斑狼疮、败血症等[4,5,6]。同时，也可用于结核病的诊断、治疗和控制[7]。本研究采用生物信息学方法从多个基因数据集中筛选关键基因，为结核病的临床诊断、治疗提供新的生物标志物。

1、材料与方法

1数据集选择和数据集处理

从GEO中下载基因表达数据集GSE34608[8]和GSE54992[9],以及miRNA表达数据集GSE116542、GSE34608和GSE25435[9](数据集微阵列信息如表1),运用GEO2R在线网络工具筛选差异表达基因(DEG)和差异表达miRNA(DE miRNA),阈值设定为P<0.05和|log fold change (FC)|>1。运用Venn在线网络工具查找共同表达的差异基因和共同表达的差异miRNA,并用微生信在线网站构建火山图将其可视化。

表1基因表达数据集和miRNA数据集微阵列信息

2 DEGs的Go和KEGG富集分析

Go功能分析通常在三个层面进行：生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞成分(cellular component, CC)。KEGG是一个全面的数据库，包含新陈代谢、其他细胞过程、机体功能和人类疾病的信息[10]。利用R软件的cluster profile文件包进行Go和KEGG通路分析，P<0.05和FDR<0.05认为具有统计学意义。通过微生信在线网站对富集结果进行可视化。

3 PPI网络的构建以及关键模块和关键基因的筛选

筛选出的DEGs上传至STRING数据库用于构建蛋白-蛋白互作网络(PPI),设置交互得分<0.4。利用Cytoscape软件的MCODE插件和CytoHubba插件筛选顶层模块和关键基因。

4 DE miRNAs-DEGs网络的构建

将所有DE miRNAs上传至TargetScan、miRDB、miWalk网站，预测miRNA的靶基因。此外，使用Venn在线工具筛选靶基因和DEGs的共同基因，并将这些基因导入Cytoscape软件，构建DEG-DE miRNA网络。

5 Thp-1细胞的培养和诱导分化

人白血病单核细胞系(Human leukemia monocytic cell line, THP-1)分离自1岁急性单核细胞白血病患儿外周血，被广泛用于炎症和免疫的研究[11,12]。取实验室保存的THP-1细胞用THP-1专用培养基(Procell公司产品)在37℃、5% CO2条件下培养。用160 nmol/L phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，24 h后丢弃含PMA的培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，补充新的培养基。

6 BCG侵染和RNA提取

卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)和Mtb诱导的免疫应答非常相似，在建立人类感染模型时，BCG接种被认为是Mtb感染的替代[13]。使用BCG对THP-1进行侵染，感染复数(MOI)为10。感染4 h后用PBS洗涤细胞3次，在THP-1专用培养基中培养24 h。使用超纯RNA试剂盒(DNase I (CWBIO中国公司产品)提取总RNA,使用PerfectStart® Uni RT&qPCR试剂盒(TransGen Biotech中国公司产品)将RNA反转录为cDNA。

7 qRT-PCR验证关键基因

使用PerfectStart® Uni RT&qPCR试剂盒(TransGen Biotech中国公司产品)和QuantStudio Real-Time PCR系统进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)(美国Thermo Fisher Scientific公司产品)。内参基因选择β-actin。2-ΔΔCT方法用于确定RNA的相对表达水平。引物序列见表2。

表2引物序列

8统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。方差分析中实验组与对照组的比较采用Student's t检验，P<0.05为差异有统计学意义。组间差异性采用Graph Pad Prism 7.0可视化。

2、结 果

1结核病差异表达基因的筛选

在数据集GSE34608和GSE54992中共有3 340个DEGs(1 364个上调和1 976个下调)和4 707个DEGs(2 396个上调和2 311个下调)(P<0.05和|log fold change(FC)|>1)。通过Venn网站筛选出两个数据集的共同DEGs 397个(225个上调和154个下调)(图1A-C)。GSE116542、GSE34608和GSE25435中分别发现了81、174和44个DE miRNA,并筛选出两个共同DE miRNA(hsa-miR-361-5p和hsa-miR-421-5p),表达均上调(图1D)。

图1 DEGs和DE miRNAs的筛选  

2 Go及KEGG富集分析

运用R软件对DEGs进行富集分析。Go分析显示，在BP,上调的DEGs主要富集在固有免疫反应、免疫反应、炎症反应、肿瘤坏死因子产生的正向调节、炎症反应的正向调节等；在CC中，上调的DEGs富集区域主要包括质膜、细胞质、胞浆、胞外区等；MF中下调的DEGs主要与蛋白结合相关(图2A-C和表3)。KEGG通路分析显示，下调的DEGs在癌症中显著富集于蛋白聚糖。相比之下，上调的DEGs在NOD样受体信号通路、吞噬体和百日咳中显著增加(图2D-E和表4)。

表4 DEGs的KEGG富集分析

表3 DEGs的Go富集分析

图2 DEGs的Go和KEGG富集分析 

3关键基因和顶层模块的筛选

利用STRING网站构建PPI网络，包括307个节点和1 072个边线，72个DEGs被排除在外，结果如图3。应用Cytoscape软件的CytoHubba插件在PPI网络中筛选出10个关键基因，分别为STAT1、DDX58、TLR8、TLR7、SAMD9L、IFI44、IFI44L、XAF1、UBE2L6、IFITM1。由MCODE插件筛选出顶层模块(图4A,B)。

图3 DEGs的PPI网络  

图4关键基因的筛选  

4关键基因的验证

利用PMA诱导Thp-1细胞分化，提取总RNA,采用qRT-PCR验证关键基因的表达水平，其中3个关键基因SATAT1,SAMD9L和IFI44表达水平显著上调，与之前的预测一致(图5A-G)。

图5 qRT-PCR检测hub基因  

5 DEG-DE miRNA网络的构建

登陆TargetScan、miRDB和miRWalk网站检索miRNA的靶基因，登陆Venn网站寻找这些靶基因和DEGs的重叠基因。结果显示，hsa-miR-361-5p的靶基因与DEGs存在一个重叠基因，hsa-miR-423-5p与DEGs存在两个重叠基因(图6A,B)。运用Cytoscape软件构建DE miRNA-DEGs网络PPI网络，结果如图7。

图6基因筛选VENN图  

图7基于DEGs和DE miRNA的PPI网络 

3、讨 论

结核病仍然是全球性的公共卫生问题，基于基因表达数据库挖掘相关差异表达基因和信号通路的生物信息学方法对于寻找结核病诊断和治疗的生物标志物至关重要。

本研究从GEO数据库中下载了两个表达谱数据集GSE34608和GSE54992,使用Venn在线工具从两个数据集中确定了379个共同DEGs。对差异表达基因进行Go和KEGG富集分析，以更好地了解其在生物学过程中的作用。Go富集分析显示，DEGs主要富集在固有免疫反应、免疫反应、炎症反应、肿瘤坏死因子产生的正向调节炎症反应的正向调节、蛋白结合等方面。KEGG富集分析显示，差异表达基因主要与NOD样受体信号通路、吞噬体和蛋白聚糖等相关。结核病是一种慢性炎症性疾病。细胞因子是结核炎症反应中的宿主细胞成分[14]。Mtb感染后，巨噬细胞发生凋亡以清除细胞内细菌，并激活宿主的固有和适应性免疫反应[15],与细胞凋亡相关的蛋白分泌也发生改变。NOD样受体(NLR)与炎症性疾病相关[16],吞噬体在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用[17]。富集分析显示这些差异表达基因与Mtb感染后的胞内反应有关，在这些DEGs中有可能筛选出结核相关的生物标志物。

应用STRING构建PPI网络，CytoHubba插件识别出10个与结核病高度相关的关键基因，包括STAT1、DDX58、TLR8、TLR7、SAMD9L、IFI44、IFI44L、XAF1、UBE2L6和IFITM1。qRT-PCR显示其中3个基因(STAT1、SAMD9L和IFI44)在Mtb-BCG感染后表达水平显著升高。信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素(IFN)信号传导的关键组成部分，在细胞因子、生长因子和激素(如IFN和IL-6)的刺激下介导各种细胞功能[18]。STAT1是应答IFN-γ和宿主防御Mtb的关键介质[19]。已有研究表明，在Mtb感染的早期阶段，磷酸化的STAT1可促进下游凋亡因子的转录激活[20]。然而Mtb感染后磷酸化STAT1迅速升高，但仅持续数小时。连续数天，未磷酸化的STAT1表达增加，抑制细胞凋亡，使Mtb逃避宿主免疫反应[21]。此外，STAT1在肿瘤发展中发挥双重作用，抑制和促进肿瘤生长[18]。SAMD9L是一个与多种临床疾病相关的7号染色体基因，包括MIRAGE综合征、共济失调-全血血细胞减少综合征、骨髓增生异常相关综合征和白血病单体7综合征。SAMD9L具有抗增殖特性，在乳腺癌、肝细胞癌和鳞状细胞癌中发挥抑制作用，并受到p53通路的抑制[22]。研究表明，SAMD9L在人血中表达显著升高，且SAMD9L可抑制Mtb感染后的细胞坏死[23]。干扰素诱导蛋白44 (interferon-induced protein 44,IFI44)是I型干扰素的关键基因，可能在自身免疫性疾病的发病机制中发挥作用[24]。然而，IFI44在Mtb感染中的作用尚不清楚。de Oyarzabal等[25]报道IFI44在TST阳性和TST阴性细胞中表达不同，IFN治疗6个月后IFI44表达下降。因此，在这些关键基因中，STAT1是结核病生物标志物的首选，STAT1及相关分子可能是活动性TB发生发展的潜在生物标志物[26]。目前关于SAMD9L和IFI44在结核病中的研究尚少，这两个基因在结核病中的发病机制尚不清楚，一些类似研究认为SAMD9L可作为潜在的TB标志物[23,26,27]。

其他关键基因如DExD/H-box解旋酶58 (DDX58/RIG-I),是一种病毒RNA模式识别受体，调节I型IFN的产生，维持免疫稳态，并在抗病毒免疫中发挥作用[28]。I型IFN通过在巨噬细胞中产生NO来保护Mtb[29]。为了逃逸宿主防御机制，Mtb进化抑制自分泌I型IFN信号。TLR7和TLR8是toll样受体(TLR)家族成员。TLR7识别相应配体后通过MyD88通路进行信号转导，引起DC细胞、T细胞、巨噬细胞的细胞反应，并分泌IL、TFN、IFN等细胞因子抵抗Mtb侵袭[30]。此外，激活TLR7可促进细胞自噬，清除细胞内Mtb。TB的易感性与TLR8多态性相关[31]。研究表明，TLR4和TLR8异源二聚化通过TLR8配体(如微生物RNA)参与Mtb的识别，诱导Th1反应[32]。IFI44L (interferon-induced protein 44-like)是I型干扰素刺激基因(type I interferon- stimulating gene, ISG),属于IFI44家族，在抗病毒活性中发挥重要作用。有研究发现IFI44L在人巨噬细胞内Mtb的正向调节和清除中起重要作用，敲除IFI44L可影响Mtb在细胞内的存活[33]。XIAP-相关因子1(XAF1)尚未被发现在结核病(TB)的发病机制中发挥作用，Mtb可能通过增加XAE1的表达来诱导免疫细胞凋亡，但尚需通过序列实验进行验证[27]。泛素结合酶E2L6 (UBE2L6)与结核病中的蛋白质泛素化和I型干扰素相关。I型IFN能引起UBE2L6的上调，UBE2L6可抑制Mtb感染后巨噬细胞的凋亡[34]。IFITM家族包括干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1),抑制IFITM1可抑制IFN-γ的抗增殖作用[35]。这些基因大多参与结核病的发生、发展或炎症反应，其作为结核病生物标志物的可行性有待深入研究。

本研究筛选出两个与结核有关的DE miRNA (hsa-mir-361-5p和hsa-mir-421-5p)。最近的研究表明，hsa-mir-361-5p通过参与增殖、凋亡、转移和耐药等生物学过程，在乳腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的发生和进展中起重要作用[36,37]。有研究认为，与病毒性疾病相比，has-mir-361-5p显著上调可能是结核病所独有[38]。此外，has-mir-421-5p可通过靶向低氧反应抑制剂(hypoxia response inhibitors, HRR)破坏炎症和抗炎过程的平衡，维持hif介导的炎症基因的持续过表达[39]。

综上所述，本研究共筛选出两个与结核有关的DE miRNA(hsa-miR-361-5p和hsa-miR-421-5p),富集分析显示差异表达基因主要与蛋白质和细胞因子分泌以及炎症反应相关。同时发现10个关键基因，其中3个(STAT1、SAMD9L和IFI44)经qRT-PCR验证。上述基因可能成为新的结核病诊断和治疗的生物标志物。DEG-DE miRNA PPI网络有助于阐明结核病发生发展的分子机制，为结核病的发病机制研究提供了一种新的方法。

基金资助:新疆建设兵团九师科技计划项目(No.2021JS010);兵团重点领域科技攻关计划项目(No.2023AB053);兵团指导性科技计划项目(No.2022ZD043);

文章来源:刘柯妤,骆婷婷,沈世杰等.基于生物信息学分析的结核病诊断及治疗新型生物标志物的筛选[J].中国病原生物学杂志,2024,19(03):263-269+274.