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幽门螺杆菌生物膜的研究进展

2021-09-23 244 上传者：管理员

摘要：幽门螺杆菌(HP)生物膜是HP附着在生物或非生物表面所形成的微生态系统。它增加了HP的难治性,最终导致HP的慢性持续性感染。越来越多的研究开始关注生物膜在HP传播、感染、致病过程中所发挥的作用及其相关的治疗策略。本文就HP生物膜的形成、致病机制及防治策略的相关研究进展作一综述,旨在为治疗HP提供新的方向。

关键词：
幽门螺杆菌
形成机制
微生态系统
慢性持续性感染
生物膜
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幽门螺杆菌(HP)是一种微需氧的革兰阴性致病菌，其主要定植于人类胃黏膜上皮黏液层，可长时间存活，甚至是终生[1]。HP的慢性持续性感染具有高致病性，不但可以引起许多胃黏膜相关性疾病如萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等[1]，还与一些血液系统疾病如不明原因缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜有关[2]。因此为了抑制HP的传播，预防和治疗HP相关疾病，有必要行根除治疗。HP在体内外均有形成生物膜的能力[3]。相比细菌的浮游生长模式而言，生物膜的形成是一种特殊的细菌生长模式。生物膜是HP毒力和适应性反应产生的结果，增加了人群中HP感染的机会，同时也为HP的根除治疗找到了新方向。

1、HP生物膜的形成

生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而黏附于生物或非生物材料表面，形成的一种由活的微生物细胞和死亡细胞及广泛的自我产生的胞外聚合物，包括多糖、核酸和蛋白质组成的结构复杂的细菌微生态系统[4]。1999年Stark等[5]首次通过在培养基中连续培养HPNCTC11637，得到了不溶于水的生物膜，证实了HP像大多数细菌一样，也具有形成生物膜的能力。随后多种不同的HP菌株的体外生物膜模型被建立研究。Carron等[4]在扫描电子显微镜下观察到在HP阳性患者的胃黏膜活检标本表面有细菌嵌入无定型基质中，即成熟生物膜形成，首次发现了人体内HP生物膜。Attaran等[6]演示了HP菌株在C57BL/6J小鼠体内胃黏膜上的定植，观察到胃黏膜中有致密的球状细菌群落组成的生物膜形成，这与先前研究结论一致。

HP生物膜的形成过程是受基因序列调控的，最开始由HP之间较弱的相互作用在附着表面形成可逆性黏附，然后由鞭毛和菌毛介导不可逆性黏附，接着菌体细胞分裂增殖形成微生物群落，并分泌胞外聚合物(EPS),HP缓慢生长形成未成熟的生物膜。随着EPS的大量堆积，HP数量的增加，生物膜逐渐发展成熟，随之密度感应调节系统被激活，调节HP不再分泌EPS，最后EPS解聚重塑，HP从生物膜中游离出来，回到浮游细菌状态，等待下次进入新的生物膜形成阶段[7]。参与到这个形成过程中的具体分子机制目前还尚不清楚，而大量研究正在表明许多基因参与并影响着这一行为过程。Wong等[8]通过对32株HP菌株按生物膜形成能力强弱分类后进行全基因组测序比较，鉴定出与HP生物膜形成有关的基因有jhp＿1117、fucT、homD和cagA基因和3种假想基因(K747＿10375、K747＿09130、K747＿06625)，它们分别编码鞭毛蛋白、α1,3-岩藻糖基转移酶、外膜蛋白、cag致病岛和3种假想蛋白，各自在运动性、脂多糖(LPS)合成、Lewis抗原合成、黏附和/或Ⅳ型分泌系统中发挥作用，这说明运动性和黏附性对生物膜的形成至关重要。

Cole等[9]发现LuxS基因作为HP基因组中的群体感应基因，它的突变导致的结果与其他细菌不同，不但不会降低HP的黏附性和影响生物膜聚集体的形成及空间结构的发展，还会增加生物膜的形成。同样cagE基因的突变也能引起生物膜形成率的增加，尽管它的突变与缺失导致Ⅳ型分泌系统的组装无法完成，但突变体却具有了更强的黏附能力，这可能与Ⅳ型分泌系统中无法分泌的某种物质引起的改变有关，也可能是cag致病岛自身突变缺失对生物膜形成有益所致。LuxS和cagE基因相似的突变效应表明它们之间可能存在一定的联系，这有待进一步探索。另外spoT基因也可以通过调控外排泵基因glup的表达，来增强HP形成生物膜的能力，敲除该基因后可抑制HP生物膜的形成[10]。

2、生物膜形成在HP致病中的作用

2.1 增加传染源

HP的主要宿主是人，大部分定居在胃黏膜，也在牙菌斑、唾液、胆汁、粪便，甚至在蔬菜、水果及水生态环境中发现。其可能的传播途径有口-口，粪-口，胃-口，口-胃等。近年来，在不同的水环境中包括饮用水、地表水、海水及废水中均检测到有HP的存在。Farhadkhani等[11]调查研究表明废水样本中HP广泛存在，甚至在部分可饮用井水中也可检测到HP。Braganra等[12]也利用FISH技术从英国供水系统提取的生物膜成分中检测到HP。对于饮用水的处理，相比发达国家采用紫外线消毒与氯或臭氧联合应用的消毒技术，中国大多数地区采用传统的氯化消毒，HP比大肠杆菌对低水平游离氯的抵抗力更强，生物膜状态下则更甚，因此HP可以在饮用水系统中持续存在，水源可能是HP潜在的一个传染源。蔬菜、水果使用含有HP的废水灌溉，在制备和加工过程可能被污染，因而携带上HP，也可以成为新的传染源。Ng等[13]利用扫描电镜和激光共聚焦显微镜等显微技术观察到HP附着在蔬菜的气孔周围或在开放的气孔内形成微菌落，一些高生物膜形成率的HP菌株甚至可以沿着角质层和不规则的缝隙形成微菌落而附着在蔬菜表面。

HP菌株生物膜形成能力越强，表面附着性越强，菌株保持可培养性的能力越强。生物膜一旦形成，可为HP提供保护，帮助其在环境中长时间存活，免受消毒和杀菌的清除;另外生物膜也可以通过单个细菌细胞的分散或大细胞聚集体的分离、脱落，使HP可以在合适的条件下游离到其他表面重新进行定植，扩大感染范围。因此，发现和清除这些起着传染源作用的水源及生蔬菜、水果等食物中所携带的生物膜是预防HP感染重要且有效的措施。但目前缺乏有效的生物膜检测手段，HP生物膜的形成是当前公共卫生事业面临的巨大的挑战，有必要加强对各种环境下HP菌群及其生物膜相关的监测，以寻求进一步解决的办法。

2.2 形成免疫逃逸

人类拥有强大的免疫系统，HP定植在胃黏膜后，可以引起以中性粒细胞和巨噬细胞为主的炎症反应，并诱导免疫细胞释放活性氧(ROS)，作为抵抗病原体的第一道防线。Zhao等[10]在体外利用低浓度过氧化氢与HP共培养来模拟HP在体内的氧化应激环境，发现低浓度的过氧化氢可以促进生物膜的形成。在体内低浓度的ROS可以激活细菌的应激反应机制而促进生物膜的形成，同时生物膜致密的胞外基质形成物理屏障可阻止ROS的进一步扩散，保护细菌免受ROS介导的毒性作用而不被清除。经抗菌因子钙卫蛋白处理后的HP，细胞表面疏水性降低，从而显示出更强的适应性并促进生物膜形成[14]。虽然钙卫蛋白作为宿主天然免疫系统的一部分，但生物膜的形成可以使HP具有逃脱钙卫蛋白的抗菌作用并持续存在于宿主体内的能力。

2.3 增加抗生素耐药性

根据最新的国内外专家共识意见[15,16]，认为无论有无症状和并发症，一旦证实有HP感染均应行根除治疗。在20世纪90年代初，HP的根除率可超过80%，而随着抗生素耐药率增长，HP根除率在一些国家可低至60%[17]。抗生素耐药是导致根除方案失败最重要的原因，生物膜以不同于浮游模式的方式增加抗生素耐药性。对比两种生长模式下阿莫西林、克拉霉素、四环素和甲硝唑对HP的最低抑菌浓度，大多数HP菌株在生物膜模式下具有更高的最低抑菌浓度，且较高的生物膜密度可能会增加生物膜的抗性[18]。Yonezawa等[3]通过建立体外HP生物膜模型行克拉霉素敏感性差异对比表明:与浮游细胞相比，HP成熟生物膜形成和最低抑菌浓度水平分别提高了4倍和16倍，最低杀菌浓度水平也提高了4倍。这些研究在对生物膜增加抗生素耐药的结论上具有一致性，这对未来用于根除HP的抗生素来说，无论是在种类还是剂量的选择方面都造成了困难。

然而，关于生物膜形成耐药的具体机制目前还未明确，大量研究表明生物膜耐药可能与以下机制有关:(1)生物膜外层的胞外聚合物即多糖和蛋白质形成一种扩散屏障，阻碍抗生素的渗透，抑制抗生素与膜内细菌的结合。(2)一方面在生存压力环境下，营养限制使生物膜内的细菌更容易发生基因突变，可能会形成更多的耐药菌株;另一方面，处于缓慢生长期或休眠状态的细菌，新陈代谢速度减慢，对抗生素的敏感性降低[19]。(3)生物膜作为一个微生物群落，内部存在多种微环境，环境之间具有异质性，细菌之间可以通过水平基因转移、整合结合元件和自然转化等行为，增加抗生素耐药性基因在生物膜细胞中的传播，从而增加了整体对抗生素的耐药性[20]。(4)形成生物膜的细菌的外排泵基因上调表达，加速了抗生素排出，增强了抗性[21]。生物膜对抗生素耐药是一种复杂的现象，可能是多种机制共同作用的结果，还有待进一步探索。

3、HP生物膜的防治策略

3.1 药物治疗

HP生物膜的形成是顽固性感染的基础，它可以作为根除HP的靶点之一。常见抗生素的使用只能减少生物膜的形成，而不能清除整个生物膜，难以达到有效的治疗效果。近年来，许多的研究致力于探索和研发能够有效消除和抑制生物膜的方法，以期提高HP的根除率。Cammarota等[21]测定了一种黏液溶解剂即N-乙酰半胱氨酸(NAC)，它能够抑制或破坏HP生物膜形成，在根除难治性HP感染且所有患者均有生物膜形成的临床试验中，在使用标准根除方案治疗前，经NAC预处理组与未使用NAC组的HP根除率分别为65%和20%(P<0.01)，且所有成功根除HP的患者复查内镜均显示生物膜消失。一些中药提取物(如大黄素、黄连素、苦参碱、黄芩苷等)一方面可能通过破坏HP菌株的荚膜，减少多糖的分泌来降低细菌的黏附力;另一方面，利用自身的含硫化合物成分更好地接近破坏生物膜的EPS从而渗透达到深层杀菌作用[22,23]。天然中草药二氢丹参酮Ⅰ(DHT)表现出强大的抗HP生物膜的活性，在最低抑菌浓度下对HPG27菌株的生物膜的清除率可达85%，且1μg/ml浓度的DHT几乎可以杀死生物膜内所有的HP，但其具体的作用机制尚不清楚。许多的中成药如荆花胃康具有较好的抗HP作用，三九胃泰颗粒能影响HP与胃上皮细胞的黏附等，推测它们可能也具有一定的抗生物膜作用，但目前还未有关于这类中成药、胃黏膜保护剂等药物在对抗生物膜治疗过程作用效果方面的研究，这可以成为未来的研究方向之一。

益生菌作为抗生素治疗的一大辅助，也具有一定的抗生物被膜作用，它可以通过抑制细菌生长和干扰群体感应系统或通过产生抗菌物质破坏成熟的生物膜来抑制生物膜的形成[24]。在根除HP生物膜的过程中，目前对使用益生菌来对抗生物膜的研究还比较少，最近有研究表明植物乳杆菌LN66无细胞上清液对HP成熟生物被膜有一定的根除作用，但它与不同的抗生素联用时会产生不同的效果，与克拉霉素联合使用时，它可以显著减弱克拉霉素对生物膜的清除作用，而当与左氧氟沙星联合使用时，会增强对生物膜破坏作用[25]。这可能与影响EPS中蛋白质和多糖含量的变化有关，但其具体的作用机制还需进一步阐明，这种抗生物膜的作用可能与特定的益生菌种类也有一定的关系，有待进一步探究。这些现有的和潜在的抗生物膜相关药物的研发与应用是防治生物膜一个重要的方面。

3.2 物理方法

有研究通过暴露在极低频电磁场(50HZ-1mT)下，诱导细菌的表型改变，降低表面黏附，使定植的细菌群体失衡，导致黏附的细胞不能激活适应机制而抑制生物膜的形成[26]。这种新型的物理方法模型的应用与构建为生物膜的防治做出了贡献，可以进一步探索和研究。

3.3 纳米技术方法

Rossella等[27]合成了新型的平均粒径小于5nm的银超纳米簇(SUNCs)，银纳米颗粒(AgNPs)具有广泛的抗菌活性，减小AgNPs的尺寸可以增强其稳定性和生物相容性、降低细胞毒性，其纳米颗粒可以穿透生物膜EPS基质，而不易受到修饰的影响，使其抗菌活性被大大地提高。Li等[28]建立了一种新的给药途径，以壳聚糖纳米粒子(CS-NPs)为核心，以鼠李糖脂(RHL)为壳层，加以亲水性的聚乙二醇修饰表面而形成的脂质聚合物纳米颗粒(LPN)，它具有很强的黏液渗透能力，当与HP生物膜接触时，外层脂质层的RHL通过介导信号、金属离子的结合或其他方式破坏EPS基质，使具有抗菌活性的CS-NPs和其中的抗生素直接作用于包裹在生物膜内的HP。此外，CS-NPs还能抑制分散的细菌在新表面上的重新黏附，以防止生物膜再生。这些新的技术与方法的应用是防治生物膜的另一重要的方面。

4、小结与展望

生物膜的形成提高了HP感染率与致病性。鉴于目前未有获得批准的HP疫苗可以用来预防和治疗HP感染，因此提高HP的根除率对遏制这一传染性的感染性疾病就显得尤为重要。生物膜的发现可以为根除HP提供新的作用靶点，相关抗生物膜方法的研发与应用将能有效提高HP的根除率。但目前大量关于生物膜的研究多是基于体外建立生物膜模型，人体是一个复杂的生态环境，还需要研究在人类体内生态环境下生物膜的特性与形成的影响因素，以期更深入地阐明生物膜的致病与耐药机制。

参考文献:

[7]宿晶,刘晨光.幽门螺杆菌生物膜形成因素及治疗策略研究[J].生物化工,2020,6(1):107-109.

[15)中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌和潸化性溃疡学组,全国幽门螺杆菌研究协作组,刘文忠,等.第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J].胃肠病学,201722(6)346-360.

[22]黄衍强,黄干荣,李晓华,等.中药提取物对耐药HP生膜形成的影响[J].医药导报,2013,32(11):1407-1409.

文章来源：沈成,李昌平.幽门螺杆菌生物膜的研究进展[J].现代临床医学,2021(05):394-397.