新 型 冠 状 病 毒 感 染 肺 炎（novel coronaviruspneumonia，NCP）是一项具有全球性危害的急性呼吸道传染病。相关文献报道表明[1-3]，感染后患者虽然经过积极治疗，症情逐渐好转，核酸检测相应转阴，然而在其恢复期，仍然有多数患者遗留不同程度的呼吸、躯体、心理等功能障碍，对患者日常生活造成了一定影响。有研究表明[4-6]，NCP急性期会引起淋巴细胞减少（尤其是T淋巴细胞）、炎症因子升高等一系列的免疫应答失调表现。而在其恢复期，患者外周血淋巴细胞检测细胞分型则表现为T淋巴细胞（CD4 +、CD8 +、CD4 + /CD8 +）比例减少为主[4]，提示恢复期患者仍处于免疫功能低下状态，这可能与病毒感染后成熟DC细胞受损有关。目前在已推行的多版新冠感染诊疗意见中均提出了NPC恢复期康复治疗相关阐述[7]。由此可知，恢复期的治疗是十分必要的。新型冠状病毒棘突蛋白的受体结构区（RBD）与 人 血 管 紧 张 素 转 化 酶2（angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2）相互作用，从而介导感染的发生[8-11]。在新型冠状病毒致病机理及疫苗研发的过程中，棘突蛋白（spike protein，S）曾作为致敏原感染小鼠，诱导SARS-CoV肺损伤及免疫紊乱[12-13]。值得注意的是，由于SARS-CoV-2不使用小鼠ACE2作为受体[14]，野生型小鼠被认为对SARS-CoV-2不太敏感。但已有相关报道证明[15]，N501Y突变的S蛋白增加了该蛋白与小鼠ACE2的结合亲和力。于野生型BALB/C小鼠鼻内接种N501Y突变的S蛋白，S蛋白可在野生型小鼠下呼吸道有效复制，引起一系列肺部病理及炎症反应。本研究拟采用气管滴注N501Y突变的S蛋白建立新冠病毒感染急性肺损伤小鼠，于感染后第10天模拟新冠感染后恢复期，深入探讨新冠病毒感染恢复期的病理及免疫损伤特征，以便进一步研究新冠病毒感染恢复期的发病机制及其防治。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雌性Balb/c小鼠30只（6 ~ 8周龄），体质量18 ~ 22 g，购于上海必凯科翼生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2023-0009，饲养于南京中医药大学附属医院SPF级动物实验室，使用许可证号SYXK（苏）2022-0070，室温20 ~ 24℃，相对湿度118第1期 喻柯瑶，等.新型冠状病毒感染肺炎小鼠模型的建立与康复研究45%~50%。本研究经南京中医药大学附属医院动物实验伦理委员会审批通过，批准编号为2023 DW032-01，遵循3R原则。

1.2主要试剂与仪器新型冠状病毒

S蛋白RBD区域（2019-nCoVSpike Protein RBD，S蛋白，上海碧云天生物技术有限公司，批号：P2331-1 mg）；流式抗体（CD3、CD4、IFNγ、IL-4、IL-17A、Foxp3、CD11b、CD11c、CD317、CD80、CD86）（Biolegend，批 号 依 次 为 ：B371019、C004205、B370994、B369431、B361617、B369750、B363381、B361853、B365891、B345916、B367228）；IL-6引物、actin引物（生工生物工程股份有限公司，批号依次为：250124283、B662302-0001）；IL-4引物（Invitrogen，HG2207260001）；RNA逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，R423-01）。离心机（德国Eppendorf公司，Heraeus Fresco21）；正置白场显微镜（Eclipse Ni-U，日本，684616）；分析流式细胞仪（BD公司，FACSCelesta）；ABI荧光定量PCR仪（上海中殷医疗设备有限公司，7500F）。

1.3方法

1.3.1动物分组及造模

30只小鼠随机分为感染后1 d（D1S组）、3 d（D3S组）、7 d（D7S组）、10 d（D10S组）和空白对照组（N组），每组6只。感染组小鼠采用2%（φ）戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后予S蛋白原液27.3μL（15μg）气管滴注，对照组进行假手术。

1.3.2标本采集

感染组分别于S蛋白感染后第1、3、7、10天取材，对照组于第10天取材。麻醉小鼠后剪开胸腔，分离气管，将左上肺组织置于4%（φ）中性甲醛溶液固定后待进行HE染色及SARS-CoV-2spike protein、ACE2免疫荧光双染。剩余肺组织置于液氮中快速冷冻用于检测肺组织匀浆中IL-4、IL6 mRNA水平。剪开腹腔，摘取脾脏，脾脏用于流式细胞术检测CD4 +T淋巴细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg）及DC细胞分群（cDC、pDC、CD80 +、CD86 +）。

1.3.3免疫荧光双染

肺组织经甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋后切片。取肺组织切片，经脱蜡、水化、山羊血清封闭、抗原灭活等处理后。4℃避光孵育抗SARS-CoV-2 spike protein抗体、抗ACE2抗体过夜，冲洗，S蛋白用AlexaFluor-488抗体染色（绿色），ACE2用CY3标记的抗体染色（红色），37℃避光孵育，1.5 h。冲洗后细胞核用DAPI染色（蓝色）。封片后荧光显微镜观察。

1.3.4 HE染色法观察肺组织病理

肺组织石蜡切片常规脱蜡、水化后苏木精染液染核，1%盐酸酒精显蓝，酒精脱水，切片干燥后伊红染液染细胞质，酒精脱水、二甲苯透明，自然风干，中性树脂封片，光学显微镜下观察肺组织病理改变。

1.3.5实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定

小鼠肺组织中IL-4、IL-6 mRNA的含量Trizol法提取小鼠肺组织的mRNA，按照试剂盒说明逆转为cDNA并稀释（终质量浓度为200 ng/μL），cDNA进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCt法计算各基因的表达量，内参基因为 β-actin。逆转录体系：RNA 1μg+4×RTbuffer 5μL+20×RT buffer 1μL，加水补足20μL。qPCR反应体系：mix 5μL+水3.6μL+上游引物0.2μL+下游引物0.2μL+cDNA 1μL。引物序列：IL-14上游：5′-TGAACGAGGTCACAGGAGAAGGG-3′，下游：5′-AGGCATCGAAAAGCC CGAAAGAG-3′；IL-6上 游 ：5′-TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′ ，下 游 ：5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′。β-actin上游：5′-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3′，下游：5′-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′。

1.3.6流式细胞术检测

CD4 +T淋巴细胞亚群、DC细 胞 分 群 收 集 小 鼠 脾 脏 ，研 磨 成 混 悬 液 后 各100μL加入标记Th1（CD3+CD4+IFNγ+）、Th2（CD3+CD4 +IL-4 +）、Th17（CD3 +CD4 +IL-17A+）、Treg（CD4 +CD25 + Foxp3 +）、cDC（CD11c + CD11b + CD3-）、pDC（CD11c + CD11b- CD317 +CD3-）荧光抗体，室温避光孵育，经洗涤离心后重悬固定，流式细胞仪上机检测，相关数据用FlowJo进行分析。

1.4统计学方法

实验数据以SPSS 21.0软件进行统计分析，GraphPad 9.0软件进行科研绘图。所有数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，采用非配对t检验分析两组间数据、One Way-ANOVA分析多组间数据。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 S蛋白滴鼻后小鼠肺组织ACE2及S蛋白免疫荧光共定位如图1所示，小鼠肺组织ACE2和S蛋白的共定位结果提示，ACE2蛋白（红色）与S蛋白（绿色）均表达于小鼠气道上皮细胞，Merge后图片提示S蛋白与ACE2蛋白完全重合。见图1。

2.2肺组织HE染色小鼠肺组织

HE染色显示，N组小鼠气道结构完整，无炎性细胞浸润，无渗出；D1S小鼠出现明显的肺组织结构紊乱，上皮细胞变性、塌陷，肺泡损伤，伴间质水肿和炎性浸润；D3S、D7S、D10S小鼠的肺组织病理表现较D1S小鼠呈逐渐减轻。相较于N组，D10S仍存在轻微渗出、少量炎性细胞浸润。见图2。

2.3 RT-qPCR结果

D10S组小鼠IL-4 mRNA含量与N组和D1S组相比，均明显升高（P<0.05）。IL-6 mRNA含量在D1S组小鼠显著升高（P<0.01）；在D10S组小鼠有所降低（P<0.05），但其表达水平仍高于N组（P<0.05）。见图3。2.4 CD4+T淋巴细胞检测结果流 式 结 果 显 示 ，与N组 相 比 ，D10S组 小 鼠Th17/Treg显著升高（P<0.01），Th1/Th2比值显著降低（P<0.05）。与D1S组相比，D10S组小鼠Th1/Th2比值有明显下降（P<0.05）。见图4―6。

2.5 DC细胞检测结果

DC细 胞 分 群 中 ，与N组 相 比 ，D1S组 小 鼠CD86 +细胞比例有明显下降（P<0.05），D10S组小鼠cDC、CD80 +、CD86 +细 胞 比 例 均 有 所 下 降（P<0.05）。见图7―9。543210N D1S D3S D10SIL-6 mRNA表达水平IL-4 mRNA表达水平D7S N D1S D3S D7S D10S151050**#***#与N组比较：*P<0.05，**P<0.01；与D1S组比较：#P<0.05。

图3小鼠肺组织IL-4、IL-6 mRNA表达情况

图2 HE染色观察肺组织病理变化

图1免疫荧光双染色结果

图6小鼠脾脏中Th17/Treg、Th1/Th2细胞比值

图5流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1、Th2细胞比例

图4流式细胞术检测小鼠脾脏中Treg、Th17细胞比例

图8流式细胞术检测小鼠脾脏DC细胞中CD80 +、CD86 +细胞比例

图9小鼠脾脏中各类DC细胞比例

图7流式细胞术检测小鼠脾脏中cDC、pDC细胞比例

3、讨论

“长新冠”[16-17]概念的引出使得对NCP恢复期有了更清晰明了的认知，随着NCP恢复期一系列症状的出现，人们逐渐把焦点从感染急性期治疗转移到恢复期后遗症的治愈。目前针对NCP恢复期后遗症相关治疗多聚焦在中医药、功能锻炼以及对症治疗上[18]，然而对其内在干预机制尚未完全明确。迫切需要一种稳定的恢复期模型用于探索、研究恢复期潜在的发病机制和治疗靶点以便能更好地进行恢复期的治疗。S蛋白是SARS-CoV-2病毒与宿主细胞表面ACE2受体结合的关键因子。已有相关研究表明，S蛋白接种ACE2转基因小鼠可诱发与SARS-COV-2感染相当的免疫和病理损伤[15，19-21]。本研究通过荧光共定位发现，采用N501Y突变的S蛋白气管滴注小鼠，S蛋白与小鼠肺部ACE2受体处于同一位置，结合第1天感染S蛋白小鼠肺部病理肺损伤严重，提示N501Y突变的S蛋白在野生型小鼠下呼吸道有效复制，引起了相关肺部病理反应。而接种该蛋白后小鼠肺部病理分别在第3、7、10天呈现逐渐缓解趋势，进一步说明感染后小鼠机体存在自我恢复过程，这与相关文献报道相符[14]。第10天小鼠肺部仍然存在一些病理损伤，亦有相关临床研究[22-24]发现：较多新冠感染后处于恢复期患者的胸部CT炎症表现虽较急性感染时有不同程度地吸收，但仍然存在轻微磨玻璃样密度影或实变，提示尽管大部分感染患者已从NCP中康复，但仍然存在肺部的长期损伤。树突状细胞（dendritic cells，DCs）是活化T淋巴细胞最重要的抗原提呈细胞，成熟DC细胞（表达CD80 +、CD86 +分子）可通过分泌细胞因子激活原始T细胞启动免疫反应，在病毒入侵过程中发挥着重要作用。相关研究[25]提示浆细胞样DC细胞（plas‐++macytoid DC，pDC）和 常规DC细胞（conventionalDC，cDC）在COVID-19患者血液中数量减少，并且可能与疾病的严重程度相关。且对COVID-19患者支气管肺泡灌洗液的流式细胞术显示，只有2型常规树突状细胞（cDC2）在肺部积聚，参与IFN-I分泌的cDC1和浆细胞样树突状细胞（pDC）在受感染的肺部中不存在[26]。Alberto等[27]的一项关于NCP患者的研究发现，DC细胞缺陷在NCP患者体内将持续长达7个月。这表明了即使患者进入了NCP恢复期，其DC细胞的缺乏和功能障碍仍可持续数月，免疫系统处于尚未恢复状态，导致组织损伤和病毒抗原的存在难以消除，从而出现一系列的NCP恢复期后遗症[28-29]。

与上述研究相符，本实验流式结果表明在D10S组小鼠体内仍然存在cDC细胞数量的下降及表达CD80 +、CD86 +分子的DC成熟细胞恢复的异常，这印证了NCP存在一个持久的免疫损伤，并且该损伤与cDC细胞缺乏及DC细胞成熟功能障碍密切相关。IL-6是NCP急性期过度免疫反应中的关键促炎细胞因子，它与新冠患者炎症风暴的发生导致的肺部炎症及肺损伤有着明确相关[30-31]。FAN等[32]的相关研究显示，即使NCP康复后，细胞因子的产生也是持续的，39名恢复期患者中有14名患者的IL6水平仍然升高；Peluso等[33]的临床研究中也观察到IL-6在恢复期患者体内仍保持较高水平。这表明，IL-6在感染后的很长一段时间内，在恢复期患者体内仍保持升高，并引起恢复期相关身体功能障碍。在本研究中，虽然D10S组小鼠肺组织中IL-6mRNA相较于D1S组小鼠有所下降，但仍高于N组小鼠，说明第10天小鼠肺部炎症损伤仍然存在。相较于IL-6，IL-4则在NCP发病过程中作用较弱，甚至无法检测到[30]，但IL-4在维持CD4 + T淋巴细胞稳态中起着重要作用。CD4 + T淋巴细胞介导的相关免疫在NCP疾病进程和预后中起着决定性的作用[34-36]。李泉等[4]的研究也发现处于NCP恢复期的患 者 外 周 血 淋 巴 细 胞 检 查 发 现 以T淋 巴 细 胞（CD4 +、CD8 +）比例减少为主。Th2与Th1、Treg、Th17共同作为CD4 +T淋巴细胞成员，正常情况下，Th1细胞与Th2细胞、Treg及Th17细胞相互制约，共 同 维 持 了 机 体 免 疫 功 能 的 平 衡[37-39]。IL-6在Th17、Treg细胞分化中起着重要作用，而IL-4与Th1、Th2细胞分化密切相关。流式结果显示感染S蛋白10 d后小鼠体内成熟DC细胞仍处于损伤状态，引起IL-4、IL-6等细胞因子分泌紊乱，从而导致Th17/Treg、Th1/Th2比值失衡。结合病理，S蛋白感染后小鼠肺部炎症反应虽然呈现逐渐恢复趋势，但体内仍存在长期的免疫功能损伤，这与临床上NCP康复期患者免疫功能特征相符[6，40-41]。这些结果也进一步说明，恢复期患者一系列后遗症表现与免疫功能低下相关，关键机制可能在于成熟DC细胞数量减少及功能障碍引起的Th17/Treg、Th1/Th2失衡，且与cDC细胞关系更为密切。而DC细胞如何引起T淋巴细胞失衡的内在机制还需要进一步研究探索。总之，D10S组小鼠在肺部病理特征、细胞因子、免疫损伤方面仍然存在失衡状态，这与临床上NCP恢复期患者机体特征相符，提示恢复期患者仍然存在长期的免疫损伤，需要进行相关康复治疗。本研究使用N501Y突变的S蛋白气管滴注小鼠建立了一种非传染性的、安全的、可靠的NCP小鼠恢复期模型，该模型可用于NCP恢复期后遗症治疗的相关研究。（本文所有作者均声明不存在利益冲突。）

参考文献:

[4]广东省药学会.新型冠状病毒肺炎抗病毒治疗临床药学指引[J].今日药学, 2022, 32(8):561-572

[6]耿洪娇,谢雁鸣.中医药对新冠病毒肺炎恢复期及出院患者免疫功能调节理论探讨[J].世界科学技术-中医药现代化,2021, 23(2):482-487.

[7]雷晓辉,惠艳娉,张妮,等.关于不同人群感染新型冠状病毒的恢复期康复治疗[J].西安交通大学学报(医学版), 2023, 44(6):969-971.

基金资助:江苏省自然科学基金项目(BK20211391);国家中医药管理局科技项目(2021ZYLCYJ05-3);南京市中医院科技项目(XGJB202202);

文章来源:喻柯瑶,汤玲玲,王博寒,等.新型冠状病毒感染肺炎小鼠模型的建立与康复研究[J].广东药科大学学报,2025,41(01):117-124.