2019年末,由武汉市起始爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全中国大面积蔓延,其他国家也逐渐出现爆发传染趋势,由于病毒感染的爆发趋势,急需短时间内寻找有效的治疗方案,以减轻疫情带来的伤害。寻找有效抑制病毒复制及阻断感染通路及研发疫苗等确实是有效的治疗方法,但完成筛选有效体外病毒抑制药物,分析药物人体内药物代谢动力学参数及药效学研究,不良反应研究等过程需要大量时间,并且病毒传播过程存在变异可能,所以除了在病毒抑制方向外,从病毒损伤人体机制角度分析,并探寻治疗方案,是更加快速可行方案。并且虽然不同病毒感染途径及发病机制不完全相同,但许多后续损伤机制却有相似之处,由损伤角度分析,可以参考既往研究经验,总结病毒造成机体损伤基因靶点传导通路,既可以借鉴以往病毒感染研究成果,又可以对未来其他病毒疫情再发提供有效的治疗方案。代谢免疫学是现代免疫学的前沿研究方向,将免疫反应与其过程造成的代谢改变结合研究,发现作用机制及损伤通路等。代谢方式及进程的变化会引起氧化还原平衡的改变,产生氧化应激损伤机体,并引起代谢异常状态。以免疫过程引起的代谢改变及对应的产生氧化应激通路的相关靶点为基础,通过网络药理学研究,发现治疗相应靶点中药。中药为天然药物,不良反应一般较小,中医理论又成形于实践医学,以患者症状为主要依据,在治疗靶点筛选出的药物中,结合中医理论,组合方剂,可在短时间内找寻新的安全的有效治疗方案。

正常环境下,细胞代谢在常氧下以三羧酸(TCA)循环和氧化磷酸化为主,低氧环境下,低氧诱导因子1α(HIF1α)激活和糖酵解表达上调。在免疫作用刺激下,细胞中代谢重新编程,包括葡萄糖摄取增加,糖酵解速率提高,磷酸戊糖途径上调以及通过TCA循环的氧化磷酸化水平降低[1]。不同功能的免疫细胞通过改变代谢途径来产生足够水平的能量储存,以支持存活并产生大量的生物合成中间体,以允许细胞生长和增殖。这些代谢途径虽然在最终产物方面各不相同,但由于共享的燃料输入以及依赖于从一种途径的产物作为关键合成前体进入替代途径的产物而紧密联系在一起。改变的代谢途径不仅带来了机体伤害,并引起氧化还原平衡改变,产生氧化应激进一步加重机体损伤。病毒入侵机体带来的免疫反应引起了炎性因子的活化,过度的免疫反应引起的炎性风暴造成机体损伤,在这个过程中免疫反应激活的炎性因子可以引起大量自由基的产生,这主要包括ROS(活性氧簇),RNS(活性氮物质)等,于此同时随着免疫细胞的活化和分化,细胞的能量需求将逐渐增加,随着代谢增强,自由基产生也同步增多,打破氧化还原平衡后,产生氧化应激反应,氧化应激作用可激活炎性因子通路,进一步产生大量炎性因子,这样的机制保证了免疫反应的持续进行并消除病原体的入侵,但过激的免疫反应,使防御机制变成的损伤途径,加重机体损伤。了解免疫作用代谢途径,通过阻断代谢通路关键点抑制免疫过激反应,并改善氧化应激状态,可对降低病毒入侵后对机体的损伤。

1、免疫反应与代谢的关系

1.1糖酵解与免疫关系

在活化的巨噬细胞和T细胞中,表现出了从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转换[2]。巨噬细胞及炎症反应过程依赖于糖酵解过程,糖酵解代谢可提供生物合成中间体,糖酵解增加可以被认为是大多数免疫细胞经历快速活化的标志性代谢变化[3]。单位量葡萄糖通过糖酵解过程产生的ATP相对于氧化磷酸化过程产生的量虽然相差较多,但糖酵解过程反应迅速,可以在短时间内提供大量ATP,糖酵解过程提供的足够ATP和生物合成中间体,使免疫细胞完成特定的效应子功能(吞噬、产生炎性细胞因子及抗原呈递等)。体内模型研究表明,通过抑制己糖激酶途径抑制糖酵解,可对巨噬细胞活化以及引起炎症过程产生抑制作用[4]。增殖细胞将上调糖酵解作为其主要的代谢途径[5],在损伤或与病原体反应的免疫细胞中更加明显,快速增殖引起的新陈代谢增强可能是转向糖酵解的主要原因。NADH是糖酵解的产物,NADH也是电子链传输(ETC)主要底物。PI3K/AKT途径是糖酵解激活过程中高度依赖的通路。研究表明PI3K的抑制剂可将LPS(脂多糖)刺激的树突状细胞的糖酵解速率降低回基线水平[6]。同时糖酵解和氧化磷酸化之间似乎存在着复杂的负反馈机制,AMPK磷酸化对于介导氧化磷酸化至关重要,LPS刺激可对AMP蛋白激酶(AMPK)磷酸化产生抑制作用,使用AMPK的小分子激活剂可以抑制了LPS诱导的白介素(IL)-12p40的产生,而AMPK抑制剂则会增强这种作用效果。

1.2三羧酸循环与免疫关系

快速细胞增殖期间,氨基酸和脂肪酸被转移以促进细胞增殖,TCA循环周期被改变破坏。炎性M1巨噬细胞显示出TCA减少和糖酵解的增加,并且在TCA循环中,柠檬酸盐和琥珀酸盐步骤被阻断破坏[7]。柠檬酸可以从线粒体转运到细胞质中,在那里可以用于脂肪酸生成和膜合成。这种断裂的TCA循环也出现在活化的树突状细胞(DC)中,以维持细胞支持抗原呈递作用所需的大量膜生成[8]。柠檬酸盐也可用于产生前列腺素以及一氧化氮(NO),前列腺素是巨噬细胞的效应分子[9],长时间NO刺激会导致对复合物I的逐渐和持续抑制,而影响电子链传输,同时NO可降低还原型谷胱甘肽在细胞内浓度[10]。柠檬酸盐还可产生衣康酸酯,这是一种具有杀菌作用的代谢产物[11],并且衣康酸酯可以通过激活抗炎转录因子来产生抗炎和抗氧化作用[12]。

LPS可通过调节丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)诱导糖酵解重编程和琥珀酸盐的积累[13]。PKM2是缺氧诱导因子(HIF-1α)重要调控基因,依赖LPS的巨噬细胞激活可诱导PKM2表达[14],PKM2诱导糖酵解过程中,相关编码酶的部分基因上调糖酵解,并可促进糖酵解中间体转移至生物合成途径,PKM2二聚体可转运至细胞核,刺激Hif-1α反式激活结构域功能,增强Hif-1α表达,并与Hif-1α相互作用,调节多种促糖酵解酶的表达[15]。PKM2可导致TCA周期中琥珀酸酯积累,过量的琥珀酸酯从线粒体中转运到细胞质中,从而破坏了脯氨酰羟化酶(PHD)的活性,从而导致Hif-1α的稳定和活化[16],增加Hif-1α依赖的IL-1β表达[17]。这种现象也被称为“伪低氧”现象,在缺氧条件下,HIF-1α不会降解,从而使其与HIF-1β亚基二聚化,转运到细胞核中并执行其转录功能[18],HIFs促进细胞代谢有氧能源生产向厌氧能源生产的转变,同时可诱导BNIP3上调而引起细胞凋亡[19]。HIF-1α在炎症介导中具有重要作用,抑制HIF-1α可促进巨噬细胞的M2表型超过M1。琥珀酸积累的另一个结果是线粒体ROS(mtROS)的产生。琥珀酸脱氢酶(SDH)不仅将琥珀酸氧化为富马酸,而且参与电子传输链,是mtROS的主要驱动力[20]。琥珀酸的积累驱动SDH,SDH可以通过反向电子转移驱动线粒体复合体I,从而增加电子向分子氧的泄漏,从而产生mtROS。

1.3磷酸戊糖途径与免疫关系

磷酸戊糖途径(PPP)与细胞溶质中的糖酵解平行进行,并通过葡萄糖-6-磷酸,果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸与糖酵解途径相互联系。PPP代谢产物包括核糖5-磷酸和赤藓糖4-磷酸,它们分别用于合成核苷酸和氨基酸。从这个意义上讲,PPP有助于蛋白质生产以及细胞存活和增殖[21]。核苷酸本身可以提供病毒复制的基础,因此病毒感染可能会增加PPP以提供其复制繁殖所需物质基础。PPP在LPS激活的巨噬细胞中增加,激活的巨噬细胞中PPP关键调控点是酶碳水化合物激酶样蛋白(CARKL/SHK),CARKL是一种七庚糖激酶,该酶可以限制PPP的通量,在M2巨噬细胞中高表达[22]。研究表明CARKL可通过抑制SOCS3mRNA表达,增加STAT-3磷酸化的途径抑制PPP途径代谢。磷酸戊糖途径对于维持M1巨噬细胞功能具有重要性,当CARKL被抑制,巨噬细胞成M1样变,但具体机制尚不清楚。免疫反应过程中,PPP上调,可产生大量NADPH,氨基酸和核苷酸,这是支持免疫细胞活化和增殖所的必需条件。NADPH在免疫细胞中具有多种功能。NADPH氧化酶使用它在呼吸爆发期间产生活性氧(ROS),但作为平衡剂,它也用于产生谷胱甘肽和其他抗氧化剂。在存在谷胱甘肽还原酶(GR)的情况下,NADPH可以作为GR辅酶,维持谷胱甘肽(GSH)的还原状态。作为GSH还原系统的辅酶,对于维持细胞中还原性GSH的含量起重要作用。NADPH可还原谷胱甘肽二硫化物,形成NADP+和两个谷胱甘肽分子。相反,NADPH可用作电子供体,为NOX氧化酶(例如NOX2)提供燃料,后者会产生有助于促进细菌清除的氧化性爆发[23]。PPP代谢产生NADPH对氧化还原平衡有着重要影响,但NOX氧化酶与谷胱甘肽之间是否存在串扰,以及对ROS的动态平衡机制目前尚未清楚。

1.4脂肪酸氧化合成与免疫关系

与炎症性快速增殖免疫细胞对氧糖酵解依赖性相反,许多非炎症性免疫细胞对脂肪酸氧化具有依赖性,如:M2巨噬细胞,Treg细胞和记忆T细胞等。细胞内不饱和脂肪酸水平上升(油酸,亚油酸和花生四烯酸等),会刺激诱导IL-1α的产生,进而导致体内炎症反应增加[24]。CPT1A是脂肪酸氧化主要限速酶,在巨噬细胞中CPT1A强制表达增加了脂肪酸的氧化,减少了脂质积累,因此减少了炎性细胞因子的产生[25]。因此,促进炎性巨噬细胞中的脂肪酸氧化,减少脂肪酸积累化可降低炎性反应。同时脂肪酸氧化在巨噬细胞分化中具有关键作用。IFNγ和LPS刺激诱导M1巨噬细胞主要利用糖酵解代谢,IL-4激活的M2巨噬细胞依赖脂肪酸氧化过程[26,27]。

同脂肪酸氧化作用相反,脂肪酸合成正向调控先天性和适应性免疫系统的促炎性免疫细胞的产生和功能。研究表明,诸如LPS和细胞因子之类的炎性刺激会触发巨噬细胞[28,29]中脂肪酸合成的增加。细胞中脂质稳态的主要依靠核转录因子固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)调控,SREBP-1c优先调节参与脂肪酸生物合成基因表达,SREBP-2主要控制胆固醇途径的基因表达[30]。脂肪酸合酶(FAS)是SREBP-1c靶基因,同时也是内源性脂肪酸合成关键酶,FAS催化乙酰辅酶A生成棕榈酸酯[31]。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导单细胞向巨噬细胞分化时,M-CSF诱导脂肪酸生物合成所需的SREBP-1c基因转录,并抑制胆固醇合成所需的SREBP-2基因转录[32],使代谢转向脂肪酸合成方向。研究证明,线粒体解偶联蛋白2(UCP2)通过上调脂肪酸合成酶(FASN)促进脂肪酸合成,并调节NLRP3炎性小体表达,进而使胱冬肽酶-1(Caspase-1)活化产生炎症反应[33]。因此脂肪酸合成是促进炎症巨噬细胞反应所必需的条件。

综合来看,脂肪酸氧化促进了非炎症性免疫细胞(M2巨噬细胞等)的表达,而脂肪酸的合成是炎症性免疫细胞表达所必须的条件。见图1。

2、氧化应激

正常机体调节中,ROS的产生与清除处于平衡状态,当ROS大量产出时,超过了还原体系(MnSOD,GSH等)时,则产生了氧化应激。大量ROS引起的氧化应激不仅对大分子蛋白造成直接和不可逆的氧化损伤,而且破坏了依赖氧化还原的信号传导通路,进而引起一系列病理生理改变。免疫反应引起的代谢改变,相应的引起了氧化还原的平衡,诱发氧化应激,使脂质、蛋白质和核酸等非特异性修饰,进而导致损伤及功能障碍。线粒体活性氧簇(mtROS)引起的氧化应激与内质网(ER)应激又有着密切关联[34],ER二硫键形成过程中内质网氧化还原素1和谷胱甘肽(GSH)作为伴侣分子协同工作,这个过程产生ROS,并消耗GSH池,当ER内氧化还原环境改变时,形成大量异常二硫键及错误折叠多肽,并使ER氧化还原失衡[35,36],这种情况下称为ER应激。ER应激与线粒体氧化应激过程中都产生大量ROS,并消耗对应的还原物质,当一种细胞器氧化应激状态产生并不断恶化时,由于细胞内氧化还原平衡的打破,同时会影响另一细胞器,并不断产生更多ROS,造成恶性循环。

图1免疫与代谢关系

ROS也是细胞内重要的传导信号,通过对氧化还原状态调整,影响着机体内各传导通路的激活状态。蛋白质磷酸酶中都具有半胱氨酸(Cys)残基,Cys残基中双硫键对氧化还原状态敏感,细胞内氧化还原状态可以调节Cys残基,进而改变蛋白质空间构象[37],导致磷酸酶活性改变。正常环境下,磷酸酶活性超过激酶活性约10倍[38],该机制使激酶在通常环境下处于失活状态[39],在氧化状态下,磷酸酶活性降低,相对的导致激酶活性增加[40]进而影响传导通路的激活与关闭。氧化还原环境中,不同Cys触发氧化所必需的氧化还原信号或氧化剂转移的阈值水平差异极大,超过七个数量级[41],这导致了不同的氧化强度引起了各异的传导通路激活状态。

NADPH氧化酶家族酶(NOX)的主要催化功能是产生ROS,NOX家族成员在大多数哺乳动物细胞类型中表达,使用NADPH作为电子供体催化氧分子还原,最终在各种细胞内以及细胞外区室中产生超氧化物或H2O2[42]。在NOX1,NOX2和NOX5中,最终产物是超氧化物,而在NOX4,DUOX1和DUOX2中则直接生成H2O2[43]。吞噬细胞中主要存在的NADPH氧化酶家族酶是NOX2,NOX2受到胞外信息(激素、细胞因子等)刺激时激活,使胞浆中的p47phox,p67phox,p40phox和Rac与p22phox上富含脯氨酸结构域与结合形成酶复合体,并使gp91phox空间构像改变,最终诱导电子的跨膜转动,发挥生物学作用[44]。实验研究表明,NOX2生成的ROS,对小鼠IAV引起的肺损伤和炎症中起关键作用,并促进了病毒的存活和复制[45]。

超氧化物通过超氧化物歧化酶(SOD)转化为H2O2,然后由过氧化氢酶或谷胱甘肽还原系统转化为水和氧气。在线粒体中与mtROS还原主要相关蛋白是锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),该酶可快速清除电子链传输中产生的超氧阴离子(O2.-),转化为H2O2,H2O2可通过线粒体膜进入细胞质,并进一步还原为水和氧气。在线粒体呼吸中产生的O2.-无法穿过磷脂双分子层,虽然O2.-的质子化形式HO2·可以穿过线粒体内膜,但在生理PH下,HO2·产生量非常小,由于这种情况的存在,导致O2.-很难离开线粒体进入细胞质内[46]。

超氧化物及H2O2的氧化反应性有限,并不会对组织细胞等带来严重损伤,但超氧化物可优先靶向含铁簇蛋白,而H2O2,则靶向半胱氨酸残基[47]。通过Fenton反应,在铁的氧化作用下,将H2O2转化为两个羟基自由基(·OH),·OH对细胞膜是可渗透的,并且可以与几乎所有生物分子发生反应,因此使它具有很高的反应性[48]。另一个高反应性分子是一氧化氮与超氧化物的反应形可以成过氧亚硝酸盐,这种生物反应速度极快,是已知最快速的生物反应之一,在无催化剂的情况下,NO和超氧化物之间的反应仅受可用底物数量的限制。见图2。

3、网络药理学方法探寻具有潜在疗效的中药

综上所述,通过抑制过激免疫引起的代谢途径变化及改善氧化还原平衡,可以改善病毒引起的部分机体伤害。选择相关靶点通过网络药理学分析找出可能具有治疗效果的中药。结合机制研究选择以下靶点(名称以UniProt数据库统一命名)为治疗点:①糖酵解代谢靶点:PIK3CG,PTEN,INPP5K,PIP4K2A,PRKAB1,PRKAG2。②TCA循环靶点:PKM,PKLR,HIF1A。③PPP途径:STAT3基因及phyticacid,D-sedoheptulose,Adenosine-5'-diphosphate,Adenosine-6'-diphosphate分子(各数据库未查询到CARKL基因任何相关中药对应数据,故以其影响通路及文献报道的相关分子为研究对象)。脂代谢靶点:SRBP1,SRBP2。④氧化应激靶点:SOD1,SOD2,CAT家族相关靶点,GS家族相关靶点。通过TCMSP,GeneCard,PubChem,UniProt等数据库收集对应分子及中药数据,通过Cytoscape分析软件进行网络药理学分析,结果表明:470种中药中包含与选择靶点相关的分子成,有373种中药所含分子与靶点相关。与靶点最相关的中药是:麻黄,桑椹,桑叶,沙棘,白果,玉米须,鸡屎藤,百部,白芍,丁香,蒲黄,柴胡,凌霄花,马齿苋,芫荽,牛蒡子,竹沥,艾叶,乌药,葛花,枇杷叶,防风,佛手,桂枝,砂仁,生姜,梅花,斑蝥,竹节参,广枣,虎杖,大枣,土茯苓,对应的靶点数均超过15个靶点(degree值大于15)。与靶点最相关的分子是:FMT,aceticacid,IPA,resveratrol,Azeton,quercetin,naringenin,(-)-epigallocatechin-3-gallate,ellagicacid,genistein,GLY,salicylicacid,morphine,nicotine,kaempferol,puerarin,artemisinin,对应靶点数均超过4个靶点(degree值大于4)。由AverageShortestPathLength,ClosenessCentrality,Radiality,Stress几项中心性相关数值分析,麻黄,桑叶,沙棘,白果,桑椹,葛花,鸡屎藤,玉米须,枇杷叶,柴胡,凌霄花,马齿苋,广枣,土茯苓,虎杖,白芍,大枣,红芪,泽漆具有最高的可转化性,可能存在更多的潜在治疗效果。见插页Ⅲ图3,表1～表3。

图2氧化应激

表1分子边度值结果

表2中药边度值结果

表3中心性相关数值结果

4、讨论

总体来看,免疫反应引起的代谢改变和引起的氧化应激主要包括以下几方面:①免疫反应促进了细胞代谢转为糖酵解方向,以此短时间内产生大量ATP,并提供免疫反应的物质基础,维持免疫反应进行。NADH是糖酵解的产物,同时也是电子链传输底物,短时间内的底物增加,使呼吸底物浓度增大,有可能增强线粒体呼吸强度,引起发大量mtROS产生。免疫反应引起的糖酵解上调主要依赖于PI3K/AKT通路,而与AMPK通路之间具有互相抑制作用。②TCA循环减少及柠檬酸与琥珀酸积累,柠檬酸的积累使其进入胞质中产生衣康酸酯,NO及前列腺素。长时间的一氧化氮作用可抑制电子链传输,并减少还原型谷胱甘肽浓度。前列腺素可以引起炎症反应,衣康酸酯除抗炎作用外,还具有抑制琥珀酸酯积累的作用。琥珀酸酯可以稳定HIF-1α不被降解,诱导HIFs表达,并参与电子链传输,引起mtROS增加。③PPP代谢途径的增加,产生氨基酸、核苷酸等供病毒复制及免疫反应底物,并产生大量的NADPH。④脂肪酸的氧化可抑制免疫反应,合成促进免疫反应。这些代谢途径的改变产生的ROS,引起氧化还原平衡改变,产生氧化应激,其主要ROS可产生于:①大量糖酵解产生的NADH引起的mtROS增加。②琥珀酸积累电子逆向传输进入复合物I产生的mtROS。③HIF-1α表达引起的mtROS增加。④NOX催化NADPH电子传输过程中产生的ROS。COVID-19中医属于疫病范畴,传染性强,易于流行,具有发病急骤,一气一病,病证相似的特点。通过病因病机分析,本病中医证型为风寒湿疫,治疗以健脾宣肺透邪为主,恢复期注重扶正,当以健脾益肺为主要治法[49]。根据网络药理学分析,各组数据中麻黄均为最佳推荐药物,麻黄辛温解表,宣肺利水,对本病主证风寒湿邪具有主要疗效。其他药物中,以辛温解表,利肺化痰,润肺止咳药物为主,其中白果敛肺止咳,百部润肺下气止咳,桑椹生津润燥,牛蒡子疏风散热宣肺利咽,竹沥清肺化痰,防风解表祛风,柴胡和解表里,桂枝解表,通经,助阳,生姜解表散寒,梅花化痰散结,竹节参,止咳祛痰。寒邪郁久化热,在数据结果中的部分药物具有辛凉解表,清热解毒功效,如:枇杷叶清肺止咳,虎杖清热解毒,止咳化痰,利湿,马齿苋清热解毒。根据病机分析,本病标在肺,本在脾,数据给出具有潜在药效的药物中,很大一部分具有补气健脾,利湿化痰功效,如:沙棘健脾,丁香温补脾肾,乌药温补脾肾散寒,葛花醒脾,芫荽温脾,解表透疹,佛手健脾燥湿化痰,砂仁化湿温脾,大枣补气健脾,红芪益气健脾。综合病机及网络药理学数据分析得出,本病中医治疗当以解表散寒,宣肺化痰止咳之法治其标,益气健脾利湿之法固其本,标本兼治,出现化热入里症状时,当适当配伍辛凉解表,清热解毒药物。本研究中,数据得出中药为代谢及氧化应激角度分析得出,并非全方位治疗角度,中医是整体观念医学,临证时,当根据中医理论结合经典方药选择治疗方案,并根据患者症状,选择配伍具有调节免疫代谢,改善氧化应激功效的药物整体治疗。

代谢免疫学是免疫学科新兴的前沿研究方向,虽然机制研究尚未完全成熟,但将免疫疾病与代谢相关联,为免疫相关疾病提供了新的治疗方向,同时也为代谢疾病在免疫方面产生的病理生理状态提供了沟通桥梁。网络药理学是药理研究的新方法,可以在大量数据中找寻特异指标,并预测潜在机制,中药研究难点是单味药物成分复杂,成方后则成分数量更为巨大,结合网络药理学可以在已知数据中推演计算,找寻治疗靶点与内在机制,是研究中药药理的科学有效方法。在代谢免疫学研究中,由于通路复杂,影响因子之间又存在大量已知及未知的串扰,单靶点调控容易出现效果差或引起其他通路异常等弊端,中药治疗特点是多靶点整体调控,结合代谢组学研究,通过代谢与免疫关系分析,可以为免疫疾病治疗带来新的方向,为临床提供有效治疗方案。

图3Cytoscape分析图

参考文献：

[49]石岩,郜贺,赵亮,等.新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎与风寒湿疫[J].中华中医药学刊,2020,38(3):4-6.

战祥毅,李嘉鑫,张薛建,申鑫惠,石岩.由代谢免疫及氧化应激角度探寻新型冠状病毒肺炎治疗方向及有效药物[J].中华中医药学刊,2020,38(05):14-20+261.

基金:辽宁省新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控应急科研攻关项目(辽科发【2020】3).