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一起新型冠状病毒引起的典型聚集性病例实验室检测结果分析

2020-10-13 234 上传者：管理员

摘要：目的通过对一起新型冠状病毒引起的典型聚集性病例样本的核酸及抗体检测结果进行分析,为实验室优化新型冠状病毒检测策略提供参考。方法对一起新型冠状病毒引起的典型聚集性病例(共计5例阳性病例)的核酸检测及血清抗体检测结果,从样本类型、采集效率、阳性结果的出现和转阴的时间等方面进行比较和分析。结果不同病例各种样本排毒情况不尽相同。14份痰液样本和8份咽拭子样本内标基因(人类细胞管家基因)CT值采用校正t检验,t′=-2.149(校正自由度v=17.226),P<0.05,结果差异有统计学意义。胶体金方法血清抗体检测到阳性结果时间晚于呼吸道样本核酸检测到阳性结果的时间。结论呼吸道样本应尽量采集到痰液,应选用带内标试剂对呼吸道样本的采样效率进行评估;对出院或解除隔离的病例应同时采集呼吸道和肠道样本;胶体金试剂检测抗体在疾病早期诊断中意义不大。

关键词：
SARS-CoV-2
人类细胞管家基因
抗体检测
排毒情况
新型冠状病毒
新型冠状病毒肺炎
核酸检测
胶体金法
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由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎疫情于2019年12月首先暴发于湖北武汉,随后蔓延至全国。绵阳市自2020年1月20日首例病例被发现以来,截止到3月14日共有22例确诊病例及3例无症状感染者被检出。

冠状病毒为单股正链的RNA病毒,有包膜,新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属。病毒对紫外线和热敏感,56℃30min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。基于目前的流行病学调查和研究结果,潜伏期为1～14天,多为3～7天;传染源主要是新型冠状病毒病人,无症状感染者也可成为传染源;主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播,在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能,其它传播途径尚待明确;人群普遍易感[1,2]。

SARS-CoV-2为新发病原体,对它的认识有一个不断加深和修正的过程。为最大限度地保证检测工作质量,尽可能做到准确及时不漏检。实验室应制定适合本实验室的检测策略并在工作中优化。本文对绵阳市一起典型聚集性病例(共计5例阳性病例)不同采样时间的呼吸道、粪便和血清样本的核酸及抗体检测结果,从样本类型、采集效率、阳性结果的出现和转阴的时间等方面进行分析,为建立及优化适合本实验室的检测策略提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1样本来源

5例聚集性病例从发病到出院后隔离观察期所采集的呼吸道样本(咽拭子、痰液)、粪便、急性期及恢复期血清。

1.1.2试剂与仪器

采用硕世生物科技股份有限公司生产的全自动核酸提取仪(SSNP-2000A)和核酸提取试剂盒进行核酸提取;采用硕世生物科技股份有限公司和上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(ORF1ab/N);采用ABI7500型实时荧光PCR仪和罗氏LightCycler480Ⅱ型实时荧光PCR仪进行核酸检测。粪便处理采用ThermoFisher公司生产的Trizol试剂;IgM/IgG抗体检测采用北京英诺特生物技术有限公司生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金法)

1.2方法

1.2.1实验室按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[3]制定本实验室SARS-CoV-2检测工作SOP。

1.2.2样本处理

1.2.2.1拭子样本(咽拭子/肛拭子)56℃60min水浴灭活,放入自封袋封口后确保样本管拧紧,充分振荡混匀,瞬时离心。

1.2.2.2深咳痰液将样本管放入自封袋封口后56℃60min水浴灭活,如采样时未加病毒保存液则加入病毒保存液约3ml,确保样本管拧紧,放入自封袋封口后充分振荡混匀(根据实际情况,一般>1min),离心取上清液(3500rpm,3～5min)。

1.2.2.3粪便样本将样本管装入自封袋封口后于水浴锅内56℃60min水浴灭活;在15ml离心管中加入2mlTRIzol,打开采样管用一次性接种环挑取约0.2g粪便样本(水样便可用带滤膜吸头的移液器吸取200μl水样便)加入已装好TRIzol的离心管中,盖紧盖子后充分振荡混匀,静置10min后短暂离心,取上清液提取核酸。

1.2.3核酸提取和实时荧光PCR法检测按试剂盒说明书及仪器操作SOP进行操作及结果判读。

1.2.4血清IgM/IgG抗体检测按试剂盒说明书进行操作及结果判读。

1.2.5实验室生物安全

1.2.5.1实验室严格按照《新型冠状病毒病毒实验室生物安全指南》[4]制定生物安全工作规程及应急预案,实验人员均经过生物安全培训并考核合格。

1.2.5.2进行样本处理、核酸提取工作按照三级生物安全防护,核酸检测工作按照二级生物安全防护。

1.2.5.3每次实验后立即将本次实验产生的医疗废弃物包括个人防护装备高压灭菌处理(121℃30min),同时采用化学指示条对高压灭菌效果进行监测,定期(每月2次)用生物指示剂对高压灭菌效果进行监测,高压灭菌后的医疗废弃物及时移交到中心的医疗废弃物暂存点。做好相关记录。

1.2.6统计分析数据采用SPSS16.0软件进行统计分析。采用t检验对两个独立样本比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1聚集性病例基本情况见表1。

表1聚集性病例基本情况

2.2聚集性病例实验室确诊及确诊前核酸检测情况见表2。核酸检测阳性日期在发病后0～7天,平均4天,考虑到能检测到核酸阳性的时间可能早于就诊采样时间,故能检测到核酸阳性距发病日期的平均天数可能小于4天。

表2聚集性病例实验室确诊及确诊前核酸检测情况

2.3聚集性病例收集到的共计12份急性期及恢复期血清采用胶体金法检测IgM/IgG抗体,结果见表3。实验室核酸检测阳性后采集的急性期血清IgM/IgG抗体均为阴性。发病后未检测到IgM/IgG抗体阳性的平均天数为7.4天。考虑到未连续采样监测到抗体转阳的时间,故发病后检测到IgM/IgG抗体阳性的平均天数应大于7.4天。

表3聚集性病例急性期及恢复期血清IgM/IgG抗体检测结果(胶体金法)

2.4聚集性病例确诊后阳性样本检测情况见表4。5例病例中4例检测到粪便阳性(采样日期为发病后7～12天),阳性率80%。不同病例呼吸道和肠道排毒情况和持续时间各不相同。

表4聚集性病例确诊后阳性样本检测情况

注:因未能连续采样检测,未检测到阳性时间可能晚于该类样本停止排毒时间。*结果为四川省疾控检测。

2.5环境样本检测结果对本起聚集性病例家居环境采集共计12份样本(涂抹样)进行检测,检出阳性样本3份,阳性率25%(表5)。

2.6因呼吸道样本,特别是咽拭子采样质量较难直观看到。为了解呼吸道样本采集质量,对22份呼吸道样本(痰液14份、咽拭子8份)的内标基因(人类细胞管家基因)CT值进行t检验分析。因方差不齐,采用校正t检验,t′=-2.149(校正自由度v=17.226),P<0.05,两组结果差异有统计学意义,痰液组的内标基因CT值较低(表6),说明痰液的样本质量优于咽拭子。

表5聚集性病例家居环境阳性样本信息

3、讨论

对呼吸道样本来说,拭子样本采样质量较难直观看到(且鼻拭子对采样技术要求较高),肺泡灌洗液样本对病人伤害较大,一般难以获得,深咳痰液为较为简便易行且采样效率更高的理想样本。同时在对呼吸道样本进行检测时应关注内标基因的CT值,如CT值较高或未检出应要求重新采样,避免因采样不合格而造成假阴性结果[5]。

本起聚集性病例中4例检测到粪便样本核酸阳性,阳性率80%(采样日期为发病后7～12天),较吴冰珊等报告的55.56%[5]高,但本数据为一起聚集性病例的小样本分析,差异无统计学意义,仅提示可对呼吸道样本未能检测到阳性的高度疑似病例采集粪便样本进行检测[6]。其中4例成人病例后续未再检测到粪便样本核酸阳性,而1例儿童病例在发病后12～34天检测到持续的粪便排毒,同时实验数据显示,呼吸道和肠道排毒不一定同时存在,在不同病例中呼吸道和肠道排毒情况及起止时间可能各不相同,有待更多数据支持。

从对聚集性病例家居环境的采样检测结果看,环境污染可能是通过接触传播造成感染的原因之一。因呼吸道排毒除可通过近距离飞沫传播外,呼吸道和肠道排毒均可污染环境或媒介,提示出院或解除隔离需谨慎。用于评估是否达到出院或解除隔离的样本需涵盖呼吸道和肠道样本(为保证采样质量,最好采到深咳痰液和粪便)。

从本次聚集性病例现有样本检测结果看,核酸检测阳性日期在发病后0～7天,平均4天,胶体金法检测到IgM/IgG抗体阳性不早于发病后7.4天。胶体金法能检测到IgM/IgG抗体的时间晚于呼吸道样本检测到核酸阳性的时间,胶体金法检测IgM/IgG抗体对疾病早期诊断意义不大。IgM/IgG抗体检测更多用于发病7～10天后核酸检测阴性的疑似病例的辅助诊断,与宁雅婷、邓杰伦等的报道一致[7,8,9]。化学发光法更为敏感,或可缩短发病后到检测到血清中SARS-CoV-2抗体的时间,但需要更多数据支持[10]。

患儿杨某某(E)血清中IgM/IgG抗体产生较晚及抗体滴度较低,可能与儿童免疫功能尚未完全成熟有关[11]。未能产生高滴度的抗体以中和病毒是否是其粪便持续高载量排毒的原因有待进一步研究。也提示可考虑对拟出院病例及无症状感染者进行IgM/IgG抗体检测,以评估其可能的排毒情况。

综上,在SARS-CoV-2检测工作中,胶体金试剂检测抗体在疾病早期诊断中意义不大。对病毒核酸检测应尽量采集到痰液样本,应选用带内标试剂对呼吸道样本的采样效率进行评估;对出院或解除隔离的病例应同时采集呼吸道和肠道样本检测病毒核酸,可考虑检测IgM/IgG抗体,以评估其可能的排毒情况。

参考文献:

[1]国家卫生健康委.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)[Z].2020-03-03.

[2]中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒肺炎防控方案(第六版)[Z].2020-03-01.

[3]国家卫生健康委.新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南[Z].2020-02-21.

[4]国家卫生健康委.新型冠状病毒病毒实验室生物安全指南(第二版)[Z].2020-01-23.

[5]吴冰珊,俞婷婷,黄枝妙,等.新型冠状病毒肺炎确诊病例粪便样本的病毒核酸检测[J].中国人兽共患病学报,2020,36(5):359-361.

[6]李萍,赵四林,陈煜枫,等.2例新型冠状病毒肺炎粪便SARS-CoV-2核酸阳性临床启示[J].国际检验医学杂志,2020,42(4):385-388.

[7]邓杰伦,王远芳,王婷婷,等.胶体金免疫层析法检测SARS-CoV-2血清抗体的临床价值探讨[J].国际检验医学杂志,2020,42(8):964-966,970.

[8]宁雅婷,侯欣,陆旻雅,等.新型冠状病毒血清特异性抗体检测技术应用探讨[J/OL].协和医学杂志,2020.

[9]李泉,刘钉宾,乔正荣,等.SARS-CoV-2IgM/IgG抗体检测在新型冠状病毒肺炎诊断中的价值[J/OL].国际检验医学杂志,2020.