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SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白抗体检测在COVID-19诊断中的应用

2020-12-01 382 上传者：管理员

摘要：目的：比较血清严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核衣壳(N)蛋白抗体和刺突(S)蛋白抗体在诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)中的价值。方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测39例COVID-19患者(COVID-19组)、40例COVID-19疑似患者(疾病对照组)和225名体检健康者(正常对照组)的血清SARS-CoV-2N蛋白免疫球蛋白(Ig)M、IgG抗体及SARS-CoV-2S蛋白受体结合域(RBD)IgM、IgG抗体。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各项指标诊断COVID-19的价值。结果：COVID-19组SARS-CoV-2N蛋白-IgM抗体、IgG抗体及SARS-CoV-2RBDIgM抗体、IgG抗体的S/CO值均高于疑似病例组(P<0.05)和正常对照组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测及SARS-CoV-2RBDIgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测诊断COVID-19的曲线下面积(AUC)分别为0.949、0.991、0.992、0.994、0.999、0.999。结论：在SARS-CoV-2感染后期,SARS-CoV-2RBD抗体的诊断效能优于N蛋白抗体。

关键词：
COVID-19
严重急性呼吸综合征冠状病毒2
刺突蛋白
新型冠状病毒肺炎
核衣壳蛋白
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目前，新型冠状病毒肺炎确诊依据仍为荧光定量逆转录聚合酶链反应和病毒基因测序。但核酸检测结果阴性不能排除严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染，需要排除可能产生假阴性的因素。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[1]首次将血清SARS-CoV-2特异性抗体作为COVID-19确诊的指标之一。徐万洲等[2]的研究结果显示，血清SARS-CoV-2免疫球蛋白M抗体和IgG抗体联合检测可以与SARS-CoV-2核酸检测互补。血清SARS-CoV-2抗体检测不仅简单、快速，而且能区分急性感染和既往感染，更适合基层医院使用。SARS-CoV-2中至少有27种蛋白质，包括15种非结构蛋白（nsp1～nsp10,nsp12～nsp16）、4种结构蛋白（S、E、M和N）和8种辅助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14)[3]。严重急性呼吸综合征冠状病毒的2种结构蛋白具有良好的免疫原性，免疫原性最强的是核衣壳蛋白，N蛋白在包装成为成熟病毒之前就已经在细胞内大量表达，是感染过程中表达数量最多的病毒相关蛋白[4]；其次是刺突（spike,S）蛋白，由S1亚单位和S2亚单位组成，S1亚单位包含受体结合域，可与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(angiotensin-convertingenzyme2,ACE2）受体结合[5]。S蛋白能诱导机体产生中和抗体，是诊断和疫苗研究的理想抗原[6]。目前，关于SARS-CoV-2哪种蛋白用于抗体检测来诊断SARS-CoV-2感染较好尚无相关报道。为此，本研究选择分别以SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白的RBD片段为包被抗原的4种酶联免疫吸附试验试剂盒，并比较其诊断性能。

1、材料和方法

1.1研究对象

选取2020年1月21日—2月8日永州市中心医院确诊的COVID-19患者（COVID-19组）39例，其中男24例、女15例，年龄5～56岁。SARS-CoV-2核酸检测均为阳性。COVID-19患者样本采集时的患病时间为（20±5)d。选取同期永州市中心医院收治的咳嗽、发热或肺炎患者40例（疾病对照组），其中男25例、女15例，年龄14～58岁。收集2019年8—10月永州市中心医院保存的体检健康者样本225份（正常对照组），其中男性样本134份、女性样本91份，体检健康者年龄18～62岁。正常对照组和疾病对照组均经核酸检测排除SARS-CoV-2感染。3个组年龄、性别差异均无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂

SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体ELISA试剂盒、SARS-CoV-2RBDIgM抗体ELISA试剂盒、SARS-CoV-2N蛋白IgG抗体ELISA试剂盒和SARS-CoV-2RBDIgG抗体ELISA试剂盒均购自同昕生物技术（北京）有限公司。检测仪器为SK201半自动酶标分析仪（深圳市盛信康科技有限公司）。

1.2.2血清SARS-CoV-2抗体检测

采集所有对象静脉血2mL，离心分离血清。所有血清检测前均经56℃灭活。根据试剂说明书，以2倍阴性对照值为Cut-off值，以S/CO>1判定为阳性。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析。数据的正态性检验采用K-S检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线评估各项指标诊断COVID-19的价值，以IgM抗体和IgG抗体任意一项阳性作为联合检测阳性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1COVID-19组与对照组血清SARS-CoV-2N蛋白抗体、SARS-CoV-2RBD抗体的S/CO值比较

COVID-19组SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体、IgG抗体及SARS-CoV-2RBDIgM抗体、IgG抗体的S/CO值均高于正常对照组（P<0.05）和疾病对照组（P<0.05）。见表1。

2.2各项指标诊断COVID-19的价值

ROC曲线分析结果显示，SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测及SARS-CoV-2RBDIgM抗体、IgG抗体、IgM+IgG抗体联合检测诊断COVID-19的曲线下面积（areaundercurve,AUC）分别为0.949、0.991、0.992、0.994、0.999、0.999，见表2、图1。

表1COVID-19组、疾病对照组及正常对照组4种血清SARS-COV-2抗体的S/CO值比较

SARS-CoV-2RBDIgG抗体诊断COVID-19的敏感性高于SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体（P<0.05），与其他各项指标之间差异均无统计学意义（P>0.05）。SARS-CoV-2RBDIgG抗体诊断COVID-19的特异性与SARS-CoV-2RBDIgM+IgG抗体联合检测差异无统计学意义（P>0.05），与其他各项指标之间差异均有统计学意义（P<0.05）。

表2各项指标诊断COVID-19的效能

图1各项指标诊断COVID-19的ROC曲线

3、讨论

本研究结果显示，SARS-CoV-2N蛋白IgM抗体诊断COVID-19的敏感性最低，且低于N蛋白IgG抗体的检出率，其原因可能与患者采集样本时患病时间已较长[距离发病的时间为（20±5)d]有关。徐万洲等[2]的研究显示，在SARS-CoV-2IgG抗体单阳性患者中，IgG抗体阳性的中位天数为24d。患者此阶段因经过治疗或病情好转，IgM水平处于下降阶段，IgG水平处于维持阶段，所以在此时间段存在N蛋白IgM抗体转为阴性的可能。SARS-CoV-2N蛋白的IgM抗体和IgG抗体的敏感性低于RBD-IgM抗体和IgG抗体，可能与这2种蛋白的特性相关。对SARS-CoVN蛋白和S蛋白的研究结果显示，N蛋白表达量较高，表达时间较早[7]，但S蛋白抗体的持久性优于N蛋白抗体。LI等[8]的研究结果显示，SARS-CoVN蛋白抗体水平在发病6个月内呈小幅下降，6～24个月时抗体水平显著下降；SARS-CoVS蛋白抗体在发病后的24个月内，抗体一直处于较稳定的水平。因此，SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白的抗体可能也具有类似的特点，但这需要收集SARS-CoV-2感染者不同时间段的样本进行抗体跟踪检测才能验证。N蛋白IgM抗体检测敏感性较低的缺点可以通过IgM和IgG联合检测进行克服。N蛋白IgM+IgG抗体联合检测诊断COVID-19的敏感性为97.4%，高于N蛋白IgM抗体的敏感性（82.1%）。

本研究结果还显示，SARS-CoV-2RBDIgG抗体的特异性最高。原因可能与SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白与其他病毒的同源性不同相关。SARS-CoV-2与SARS-CoV的N蛋白序列相似性为94%，蛋白同源性很高，说明N蛋白比较保守，易于其他病毒发生交叉反应。WRAPP等[9]的研究结果显示，SARS-CoV-2S蛋白与SARS-CoVS蛋白的氨基酸序列相似度为76.47%;3种针对SARS-CoVRBD的多克隆抗体与SARS-CoV-2的RBD完全没有结合力。由此可见，尽管SARS-CoV-2与SARS-CoV有较高的同源性，但二者RBD片段的交叉反应较少。因此，将S蛋白中的RBD作为抗原来检测血清中的抗体，对诊断SARS-CoV-2感染有较好的特异性。此外，SARS-CoV-2RBDIgM抗体的特异性低于RBDIgG抗体的特异性（P<0.05）。在正常对照组中，13份RBDIgM抗体假阳性样本的S/CO值为1.25(1.13～1.60），均为弱阳性样本，可能与血清中存在类风湿因子、嗜异性抗体、补体等干扰物质有关。

本研究的样本采集时间处于SARS-CoV-2感染的后期。ROC曲线分析显示，此阶段SARS-CoV-2RBD抗体的Youden指数高于N蛋白抗体。因此，对于已处于SARS-CoV-2感染后期的患者，采用S蛋白RBD抗体诊断COVID-19的临床价值更高，但在COVID-19早期诊断中的价值还需进一步研究。

综上所述，SARS-CoV-2S蛋白RBD抗体检测在SARS-CoV-2感染后期的患者中价值更高。本研究的不足之处在于样本量较小，采样时患者发病时间已较长，未能动态监测SARS-CoV-2不同感染阶段抗体的变化。因此，本研究的结论还需大样本量进行验证。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)[EB/OL].(2020-03-04)[2020-03-04].

[2]徐万洲,李娟,何晓云,等.血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值[J].中华检验医学杂志,2020,43(3):230-233.

田亚玲,鲁君艳.SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白抗体检测在COVID-19诊断中的应用[J].检验医学,2020,35(11):1136-1139.