2019年12月以来，新型冠状病毒以武汉为中心暴发，其传染性强，传播速度较快，截止2020年2月20日，全国累计确诊74677例，累计死亡2121例。世界卫生组织（WHO）已将此次病毒引发的疫情列为“国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）”。“细胞因子风暴”由FERRARA在1993年首次提出[1]，由于2005年高致病性H5N1禽流感、2009年H1N1猪流感的暴发而被广泛关注。ALIMUDDIN指出[2]，SARS-CoV-2感染的患者血清中炎症因子水平显著升高，此次病毒感染与“细胞因子风暴”具有相关性。2020年1月24日，HUANGC等[3]在《柳叶刀》发表了一篇41名新型冠状病毒肺炎的回顾性研究。研究发现SARS-CoV-2感染患者血清中IL-1β，IFN-γ，MCP-1等炎症因子水平升高，可能会激活1型辅助性T（T-helper-1，Th1）细胞；与非ICU患者相比，ICU患者血清中CXCL-10，MCP-1，TNF-α，巨噬细胞炎症蛋白1（macrophageinflammatoryprotein1，MIP-1)，IL-2，IL-7，IL-10等因子水平显著升高。2020年1月30日CHENN等[4]分析了99例新型冠状病毒肺炎确诊病例，大多数患者在接受治疗后情况良好，但有17名患者出现急性呼吸窘迫综合征，其原因可能与“细胞因子风暴”有关。因此抑制以上炎症因子的产生对治疗SARS-CoV-2至关重要。

花生四烯酸是一种不饱和脂肪酸，由磷脂酶A2催化而来，可通过环氧合酶（、脂氧合酶与细胞色素P450途径生成多种代谢产物[5]。相关研究指出AA可调节MCP-1的表达[6]，AA代谢通路也与细胞因子产生相关。COX是流感诱导炎症的上游驱动因子，COX抑制剂可抑制IL-6，TNF-α，IFN-α，IFN-β等炎症因子的表达。LOX通过刺激IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1等炎症因子的产生，参与多种炎性反应过程，促进白细胞游走，引起多器官功能衰竭[7]。环氧化物水解酶属于CYP450通路，可将活性高的代谢产物环氧二十碳三烯酸水解为活性极低的代谢产物二羟基二十碳烯酸，抑制sEH可提高EETs的水平，降低TNF-α和IL-1β的表达[8]。PLA2被认为是由炎症引起多器官功能衰竭的重要调节酶，PLA2激活后刺激TNF-α等炎症因子的释放，加重局部炎症[9]。综上可得，抑制AA代谢通路可抑制多种炎症因子的产生，寻找AA抑制剂对于“细胞因子风暴”的缓解有重要意义。

本次病毒感染属于中医“疫病”范畴，中药在防治疫病中发挥不可磨灭的作用，也在调节“细胞因子风暴”过程中发挥特色优势。因此本研究基于虚拟筛选技术，对中药化学成分数据库进行筛选研究，发掘具有潜在抑制“细胞因子风暴”的成分、中药及方剂，为临床研究提供参考。

1、资料与方法

1.1 中药活性成分的获取

本研究基于中药化学成分数据库获取中药的活性成分。将小分子转化为三维结构并赋予CHARMm力场，以备后续筛选研究。后续药效团的构建与计算等操作均在DiscoveryStudio4.0（DS4.0）中进行。

1.2 花生四烯酸代谢通路关键靶点药效团的构建与评价

花生四烯酸代谢途径是炎症反应的关键通路，由COX，LOX，CYP450组成。COX-2、微粒体前列腺素E合酶-1是COX通路的关键靶点；12-LOX，5-LOX与白三烯A4水解酶在LOX通路产生关键作用；sEH则为CYP450中的关键靶点[10]。此外，分泌型磷脂酶A2与胞浆型磷脂酶A2均属于磷脂酶A2，对花生四烯酸有催化作用。本研究依据花生四烯酸途径中关键靶点进行药效团模型构建及筛选研究。

1.2.1 训练集与测试集的收集

sPLA2-ⅡA，COX-2，5-LOX，LTA4H抑制剂的药效团模型已构建成功[11-12]，可直接用于筛选研究。检索BindingDatabase数据库获得人源mPGES-1，12-LOX，cPLA2α，sEH的靶点以及具有抑制作用的活性成分。挑选针对不同靶点的训练集及测试集，训练集由结构差异性大且具有一定活性梯度的化合物组成，测试集由100个剩余活性化合物与300个非活性化合物组成。非活性化合物来源于Drug Bank数据库。使用Prepare Ligands和Minimize Ligands模块对训练集与测试集中化合物进行预处理和能量最小化。训练集用于生成药效团模型，测试集用于药效团模型的评价及验证。

1.2.2 药效团模型的构建

将训练集中的化合物按活性排列，并赋予相应的权重。活性较高的化合物Principal设置为2，Max Omit Feat设置为0，意指活性高，为模板分子；活性中等的化合物Principal设置为1，Max Omit Feat设置为1；活性较低的化合物Principal设置为0，Max Omit Feat为2，常用于定义排除体积。首先使用Feature Mapping模块对训练集进行药效特征的识别，识别的药效特征主要为氢键受体、氢键供体、芳香环、疏水基团、芳香性疏水基团（Z）。基于识别结果，采用Common Feature Pharmacophore Generation模块对训练集进行构象分析，药效特征为A，D，R，H，Z的组合，设置最优构象BEST，生成药效团模型，每个靶点均获得10个药效团模型。

1.2.3 药效团模型的评价

使用LigandProfile模块对测试集进行匹配分析以优选药效团模型。评价参数包括有效活性命中率（HRA）、辨识有效性指数（IEI）及综合评价指数（CAI）[13]。HRA表示模型辨识活性化合物的能力，IEI表征区分活性与非活性化合物的能力，CAI表征模型的数据库搜索能力。最终挑选的最优药效团模型用于中药活性成分辨识研究。

1.2.4 药效团的虚拟筛选

基于以上获得的最优药效团模型，对中药成分数据库进行虚拟筛选。使用Lipinski五规则对筛选结果进一步评价，得到具有类药性质且fitvalue值高于0.7的活性化合物。对活性化合物的来源中药进行频数统计，并结合《国家新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》[14]中用于治疗的新型冠状病毒的中药方剂进行分析。

2、结果

2.1 花生四烯酸代谢通路关键靶点药效团模型的评价验证

基于测试集与药效团模型的匹配结果，计算HRA，IEI，CAI指数，挑选指数高的模型作为最优药效团模型，为评价模型的可靠性，将已知活性成分与模型进行匹配，评价模型的可靠性。将最优药效团模型12-LOX与阳性药ML355，cPLA2α与阳性药奥利司他，mPGES-1与5TL9中原配体[15]，sEH与4JNC中原配体[16]相匹配，原配体或阳性化合物的fitvalue均大于0.7，进一步验证了模型的可靠性。

2.2 花生四烯酸代谢通路关键靶点药效团虚拟筛选

TCMD数据库中共获取23034个活性成分，保留与药效团模型匹配值>0.7的成分，筛选获得的代表性成分及中药。12-LOX与丹参二醇A、cPLA2α与东北贯众素、mPGES-1与厚朴木脂体I、sEH与忍冬苦苷匹配情况。将活性成分与中药相对应，进行频数统计，对花生四烯酸代谢通路中关键靶点具有潜在抑制作用的中药分别为厚朴、生姜、金银花、大黄、丹参、黄芩、栀子、人参、牛蒡子、绵马贯众、赤芍、山药，其中，厚朴可能通过作用于mPGES-1，5-LOX，LTA4H抑制花生四烯酸代谢通路，生姜可能通过作用于COX-2，mPGES-1，sPLA2-ⅡA抑制花生四烯酸代谢通路。

2.3 抑制花生四烯酸通路潜在中药及方剂分析

基于以上筛选获得中药在抗新型冠状病毒方剂中的作用，对其进行分析，结果显示，藿香正气胶囊、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、清肺排毒汤、血必净注射液、热毒宁注射液、痰热清注射液对花生四烯酸通路具有潜在抑制作用，可能通过缓解“细胞因子风暴”抑制新型冠状病毒引起的肺炎。

对治疗新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案进行分析：诊疗方案分为医学观察期和临床治疗期。医学观察期临床表现有2种情况，第1种情况为乏力伴脾胃不足，使用藿香正气胶囊加以缓解。藿香正气胶囊功效为解表化湿、理气和中，具有免疫调节、抗炎、改善电解质及代谢紊乱等药理作用[17]。厚朴具有潜在抑制花生四烯酸代谢通路的作用，在藿香正气胶囊中具有行水消满、燥湿祛浊之效。研究显示，藿香正气胶囊可降低LPS诱导的TNF-α，IL-6，IL-12等炎症因子的产生，减轻炎症反应[18]。第2种情况为乏力伴发热，推荐中成药为金银花清感颗粒、连花清瘟胶囊。金花清感颗粒是在H1N1流感期间获得的有效方剂，在治疗流感方面具有独特优势，主要用于治疗流感风热犯肺症[19]。金花清感颗粒的预测中药为金银花、牛蒡子、黄芩，方中金银花可疏散风热、消暑除烦，牛蒡子疏利咽喉，黄芩苦寒，长于清泄少阳与上焦之热[20]。连花清瘟胶囊的预测中药为金银花、绵马贯众、大黄。金银花为君药，具有清热解毒、疏散风热之效，绵马贯众、大黄为佐药，合而用之，既助清肺解毒、宣肺泄热，又化湿浊而理气和中[21]。临床研究显示，金花清感颗粒可显著降低流感患者血清中IFN-γ与C反应蛋白细胞因子水平[22]。连花清瘟胶囊在应用于小儿肺炎的治疗中，显著降低血清中IL-10，IL-17，TNF-α等炎症因子水平，减缓炎症渗出物对肺功能的损伤[23]。

临床治疗期分为轻型、普通型、重型、危重型。清肺排毒汤适用于轻型、普通型及重型的治疗，命中的中药为生姜、山药、黄芩。此次肺炎病因为湿困脾闭肺，气机升降失司。而此方为麻黄汤与五苓散的结合，即祛寒闭又祛湿，适用于本次肺炎的治疗[24]。血必净注射液、热毒宁注射液、痰热清注射液适用于重型及危重型。血必净注射剂是基于“血府逐瘀汤”加减而成，有红花、赤芍、川芎、丹参、当归5味中药，具有溃散毒邪，消除内毒素的作用，用于危重及重症SARS-CoV-2患者的治疗。研究表明，血必净注射剂可抑制大鼠肺部组织中TNF-α、转化生长因子-β、IL-13等细胞因子水平[25]。血必净注射剂联合参附注射液或盐酸氨溴索均有改善患者细胞因子水平的作用[26-27]。热毒宁注射液与痰热清注射液的命中中药均含金银花，热毒宁注射液善于清热解毒、宣散风热，痰热清注射液善于清热化痰、解毒散结，两方清热之效皆由金银花所致。当热毒宁与痰热清用于肺炎治疗时，血清炎症因子CRP，IL-6，IL-8，IL-10水平均降低[28-29]。

结合以上治疗新型冠状病毒方剂对花生四烯酸代谢通路的抑制作用以及文献中对细胞因子水平的调节作用，提示“细胞因子风暴”的缓解与新型冠状病毒的治疗具有潜在相关性，以上方剂可能通过抑制“细胞因子风暴”改善临床症状，治疗SARS-CoV-2。

3、讨论

临床数据显示，自SARS-CoV-2暴发以来，部分患者在短期内病情出现急剧恶化，出现多器官衰竭导致死亡[3]。综合SARS-CoV-2感染患者体内细胞因子水平以及筛选所得治疗方剂进行分析，此现象可能与病毒感染产生的“细胞因子风暴”存在一定联系。本研究利用药效团技术通过对AA代谢通路相关靶点进行筛选研究，发现了338个对AA代谢通路具有潜在抑制作用的中药活性成分，主要归属于厚朴、生姜、金银花、大黄、丹参、黄芩、栀子、人参、牛蒡子、绵马贯众、赤芍、山药。与诊疗方案进行结合分析，发现以上中药存在于藿香正气胶囊、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、清肺排毒汤、血必净注射液、热毒宁注射液、痰热清注射液等用于治疗SARS-CoV-2的方剂中。提示以上方剂可能通过抑制“细胞因子风暴”治疗SARS-CoV-2，为探索治疗新型冠状病毒中药及方剂的治疗机制和临床用药提供参考。“细胞因子风暴”与SARS-CoV-2的相关性仍需进行深入临床研究，为进一步开展SARS-CoV-2的治疗提供依据。

由于病毒具有较高的传染性，进行传统的药物筛选难度高、消耗大。虚拟筛选可模拟受体与配体之间的相互作用，适用于大规模的筛选和评价，具有快速高效、成本低的优点，并提高先导化合物发现效率。虚拟筛选技术主要分为分子对接与药效团技术。分子对接通过辨识小分子与蛋白受体的相互作用方式来筛选活性成分，对于结合位点明确的受体，可使用分子对接筛选发现活性成分。药效团技术是通过提取不同结构活性分子的关键药效特征并将其在空间中重新排列，用于筛选能与之相互匹配的活性成分，有助于发现具有结构差异的化合物。二者相辅相成，互相补充。分子对接是通过原配体定义活性口袋，其特异性较高，可针对已知的活性化合物结构去寻找。但对于具有一定差异结构的化合物，更适用于药效团模型的筛选。因此本研究在挑选训练集时选取结构差异性大且具有一定活性梯度的化合物，将化合物按活性排列，赋予相应的权重，以此构建药效团模型，采用HRA，IEI，CAI参数挑选最优药效团模型，并用阳性药以及数据库中原配体进行验证，一定程度上提高了模型的准确性。但虚拟筛选结果仍需进行进一步的活性验证。

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